甲苯胺藍(lán)介導(dǎo)的光動(dòng)力對(duì)大鼠口腔感染傷口的影響

甲苯胺藍(lán)介導(dǎo)的光動(dòng)力對(duì)大鼠口腔感染傷口的影響

光動(dòng)態(tài)治療是利用特定波長的激光激發(fā)光敏劑，并與氧結(jié)合產(chǎn)生具有細(xì)胞毒性的單態(tài)氧和其他活性氧成分。作為一種治療腫瘤和非腫瘤的方法，獲得了臨床認(rèn)可。20世紀(jì)初期,人們就知道染料和光的聯(lián)合應(yīng)用可以在體外殺死特定的微生物,現(xiàn)已有文獻(xiàn)報(bào)道:此項(xiàng)技術(shù)可有效地殺滅口腔病原微生物和耐藥菌株。細(xì)菌的耐藥性是院內(nèi)感染的重要因素,因此大量研究致力于發(fā)掘抗感染的替代療法,例如光動(dòng)力。甲苯胺藍(lán)已被證明是一種能有效對(duì)抗許多微生物及其毒性產(chǎn)物的光敏劑,其介導(dǎo)的光動(dòng)力在治療局部感染中可能成為抗生素的替代方法。本研究利用甲苯胺藍(lán)介導(dǎo)的光動(dòng)力對(duì)大鼠口腔感染創(chuàng)口進(jìn)行處理,觀察其滅菌效果及對(duì)病損的治療作用,為臨床替代抗生素治療局部感染提供參考。1材料和方法1.1培養(yǎng)基和儀器Wistar大鼠(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬二院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供);甲苯胺藍(lán)(TB,中國上海SinopharmChemicalReagent公司用無菌蒸餾水制成1mg/mL的溶液,0.22μm濾過膜濾菌,避光保存);實(shí)驗(yàn)室金黃色葡萄球菌純菌株,滅菌磷酸鹽緩沖液稀釋到1010/mL濃度(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供);甘露醇高鹽瓊脂培養(yǎng)基(青島海博生物技術(shù)有限公司)。HPD7404光動(dòng)力治療儀(美國,波長為635nm的半導(dǎo)體激光,連續(xù)輸出功率0~520mW,光纖直徑0.6mm);MT-600小型振蕩器(廣州光機(jī)電工程研發(fā)中心研制,功率<10W,調(diào)速范圍0~3000r/min)。1.2方法1.2.1進(jìn)行牙斷裂操取體質(zhì)量(170±10)g雄性wistar大鼠36只,氟乙烷吸入麻醉,去除上頜第一磨牙腭側(cè)牙齦及其下結(jié)締組織,建立2mm×2mm切割創(chuàng)口。止血后,將20μL金黃色葡萄球菌液注入創(chuàng)口并保持5min。普通飼料常規(guī)飼養(yǎng)24h后用于實(shí)驗(yàn)。1.2.2-半導(dǎo)體激光方法使用溫度和時(shí)間感染創(chuàng)口模型建立后的36只大鼠隨機(jī)分為12J組(激光能量12J/cm2)、48J組(激光能量48J/cm2)2個(gè)治療組和1個(gè)對(duì)照組(無光敏劑和激光照射,局部用生理鹽水)。麻醉之后用鼠牽引器牽開口腔。創(chuàng)口用生理鹽水沖洗后,每個(gè)創(chuàng)面放置3個(gè)無菌紙尖并停留10s采集第一次細(xì)菌樣本,保存于500μL滅菌磷酸鹽緩沖液中。在兩光動(dòng)力治療組的創(chuàng)口缺損處涂10μLTB,并避光保留10min,分別用12J/cm2和48J/cm2半導(dǎo)體激光以0.5cm2光斑面積照射感染創(chuàng)口2min。對(duì)照組只單獨(dú)用10μL生理鹽水處理創(chuàng)口缺損處,不用激光照射。隨后以上述同樣方法第二次采集細(xì)菌樣本。所有感染創(chuàng)口只治療1次,隨后觀察即刻滅菌效果及創(chuàng)口愈合狀況。1.2.3菌落測定和轉(zhuǎn)染兩次細(xì)菌樣本用振蕩器震蕩30s后,滅菌磷酸鹽緩沖液系列稀釋,取100μL菌液接種于甘露醇高鹽瓊脂培養(yǎng)基,37℃需氧培養(yǎng)48h,數(shù)碼照相后,用圖像處理軟件ImagePro-pus5.0進(jìn)行處理并計(jì)算長出的菌落,記錄數(shù)據(jù)。1.2.4實(shí)際創(chuàng)客率檢測治療后大鼠每天稱重,同時(shí)在創(chuàng)口一側(cè)放置無菌牙周探針作參照,垂直于創(chuàng)面進(jìn)行照相。用MATLAB7.0.1圖像處理軟件對(duì)照片中的創(chuàng)口面積進(jìn)行處理。以照片中的牙周探針刻度的1mm長度為基準(zhǔn),截取1mm2面積,作為基準(zhǔn)面積,另確定創(chuàng)口邊界后截取照片中創(chuàng)口面積,以下列公式計(jì)算實(shí)際創(chuàng)口面積。實(shí)際創(chuàng)口面積=照片中創(chuàng)口面積/基準(zhǔn)面積。因?yàn)閯?chuàng)口邊界的確定為手動(dòng)完成,所以每個(gè)創(chuàng)口邊界各由3個(gè)有經(jīng)驗(yàn)的操作者確定,共截取3次取平均值。7d后注意觀察創(chuàng)口表面是否完全愈合,完全愈合標(biāo)準(zhǔn)為組織顏色正常,質(zhì)地較韌,探診無出血。口腔數(shù)碼微距照相放大后,未見創(chuàng)口。1.3統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS13.0軟件進(jìn)行重復(fù)測量方差分析,兩兩比較用q檢驗(yàn),檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)α=0.05。2結(jié)果2.1tb治療前后tb能量與菌落數(shù)之間的關(guān)系各組初始菌落平均229CFU/mL到240CFU/mL,無顯著差異(P>0.05)。光動(dòng)力治療后,兩治療組菌落數(shù)與治療前相比均顯著減少(P<0.05)。對(duì)照組雖較治療前稍有減少,但無顯著差異(P>0.05)。各組治療后均未達(dá)到完全滅菌效果,其中以48J/cm2組最好,3組間有顯著性差異(P<0.05)(表1)。光能量與滅菌效果之間的關(guān)系見(圖1)。在TB濃度1mg/mL,激光能量12J/cm2時(shí),菌落數(shù)減少約85%;而激光能量為48J/cm2時(shí),菌落數(shù)減少約93%。不同英文字母之間比較有顯著性差異(P<0.05)實(shí)驗(yàn)組中48J組滅菌率最好,平均92.64%。各組間有明顯差異,F=3373.375,P﹤0.001。2.2創(chuàng)傷率和愈合時(shí)間模型建立后3組創(chuàng)口面積均逐漸增加,到第2、3天達(dá)到高峰,但兩光動(dòng)力治療組明顯低于對(duì)照組,其中48J組平均病損面積最小(P<0.05)。此后,到第7天3組創(chuàng)口面積均逐漸變小,其中48J組最小,對(duì)照組最大,3組間有顯著性差異(P<0.05)(圖2)。48J組在第10天有創(chuàng)口開始完全愈合,到13d全部動(dòng)物創(chuàng)面均完全愈合。12J組在12d出現(xiàn)創(chuàng)口完全愈合,全部愈合時(shí)間為15d,對(duì)照組到第14天才出現(xiàn)創(chuàng)口完全愈合,全部愈合時(shí)間為18d,時(shí)間最長(圖3)。各組創(chuàng)口完全愈合時(shí)間有顯著性差異(P<0.05)。0d和1d各組之間無明顯差別(F=0.135,P﹥0.05);第2~7天實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間均有差別(P﹤0.01)。3光動(dòng)力治療口腔東北部感染的作用甲苯胺藍(lán)是一種有效對(duì)抗許多微生物及其毒性產(chǎn)物的光敏劑,由其介導(dǎo)的光動(dòng)力療法在殺滅病原微生物方面有很多優(yōu)勢,它能夠立刻與微生物結(jié)合,幾分鐘之內(nèi)就可進(jìn)行光照滅菌。不但起效快而且不需要在病損部位長時(shí)間保持較高的藥物濃度。而傳統(tǒng)的抗生素療法通常需要幾個(gè)小時(shí)才能發(fā)揮相同的效果。另外光動(dòng)力還可以防止目標(biāo)微生物產(chǎn)生耐藥性,因?yàn)槠錃⒕臋C(jī)理和抗生素、消毒藥物不同,光動(dòng)力對(duì)微生物殺傷的具體機(jī)制被認(rèn)為是激光激發(fā)光敏劑產(chǎn)生的單態(tài)氧作用于細(xì)胞膜,使胞漿膜蛋白和DNA損傷。作為一種安全的光敏劑,甲苯胺藍(lán)還被用于外科腫瘤界限的確定,而且曾經(jīng)作為口服藥治療急性苯胺中毒沒有發(fā)生毒性反應(yīng)。甲苯胺藍(lán)還具有價(jià)格優(yōu)勢,相對(duì)于其他臨床用光敏劑如光敏素(Photofrin),δ-氨基乙酰丙酸(ALA)和親脂性二氫卟酚(Ce6),要便宜得多。本研究采用甲苯胺藍(lán)濃度為1mg/mL,因?yàn)樗商峁┳詈玫臍⒕Ч?。目前有學(xué)者開始研究光動(dòng)力對(duì)某些口腔感染的治療作用,如牙周炎和種植體周圍炎等。據(jù)報(bào)道,大鼠幾種感染創(chuàng)口模型已經(jīng)建立成功而且應(yīng)用于光動(dòng)力治療之中。但是光動(dòng)力對(duì)口腔創(chuàng)口感染的治療尚未見報(bào)道,而口腔的理化環(huán)境和身體其他部位有很大區(qū)別。本研究首次證實(shí)了甲苯胺藍(lán)介導(dǎo)的光動(dòng)力對(duì)于建立在大鼠口腔金黃色葡萄球菌感染創(chuàng)口的治療作用。實(shí)驗(yàn)中,照射時(shí)間設(shè)定為2min(臨床上過長時(shí)間不實(shí)用),最高光能量為48J/cm2,遠(yuǎn)低于安全劑量。在48J/cm2和TB1mg/mL組合下約93%的細(xì)菌被殺滅,取得了理想的殺菌效果。表明在較低的甲苯胺藍(lán)濃度下12J/cm2、48J/cm2光能量對(duì)口腔創(chuàng)口感染可提供有效的光動(dòng)力殺菌效果。盡管光動(dòng)力治療后,有的病損沒有停止發(fā)展,但在病變高峰時(shí),光動(dòng)力治療組病損的面積顯著小于對(duì)照組(48J組和對(duì)照組平均相差5.2mm2),在以后的時(shí)間段內(nèi),光動(dòng)力治療組仍表現(xiàn)為更小的病損面積,而且全部愈合時(shí)間也比對(duì)照組提前(48J組提前5d)。提示:光動(dòng)力治療具有促進(jìn)大鼠感染創(chuàng)口愈合的作用。其機(jī)理可能是由于光動(dòng)力介導(dǎo)炎癥反應(yīng)或是光動(dòng)力對(duì)細(xì)菌毒素的破壞作用,因?yàn)殡m然許多因素均能影響感染創(chuàng)口的愈合,但是細(xì)菌的感染依然起著重要因素。例如Hamblin等經(jīng)過光動(dòng)力對(duì)小鼠感染綠膿桿菌開放創(chuàng)口進(jìn)行治療,其中90%治療鼠存活下來。FatenGad等報(bào)道:使用聚左旋賴氨酸親脂性二氫卟酚(poly-L-lysine-Ce6)介導(dǎo)的光動(dòng)力治療大鼠腿軟組織感染模型,治療側(cè)的愈合明顯好于非治療側(cè)。Tak-WahWong等用100μgofTB和廣譜紅光治療致命性V.vulnificus感染的創(chuàng)口,結(jié)果發(fā)現(xiàn):即使是在感