新藥研發(fā)中藥物分析方法建立與驗證

新藥研發(fā)中藥物分析

方法建立與驗證袁艷娟2015.04.172023/10/152分析方法的設(shè)計依據(jù)分析方法建立的一般步驟分析方法驗證的內(nèi)容與要求藥物分析應(yīng)用示例內(nèi)容提要2023/10/153第一節(jié)

分析方法的設(shè)計依據(jù)建立分析檢測方法的主要依據(jù)待測藥物的理化性質(zhì)及在生物體內(nèi)的存在狀況分析測定的目的與要求生物樣品的類型與預(yù)處理方法實驗室條件2023/10/154一、待測藥物的理化性質(zhì)及體內(nèi)存在狀況準確測定生物樣品中的藥物或其特定代謝物

——預(yù)處理——待測物從結(jié)合物或綴合物中釋放選擇樣品預(yù)處理方法——首先應(yīng)考慮

——待測藥物的理化性質(zhì)

——藥物在生物體內(nèi)的存在狀況

——藥物在生物體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化(代謝)途徑2023/10/155(一)待測藥物的理化性質(zhì)

藥物的pKa值、親脂性、溶解度、分配系數(shù)等——預(yù)處理及檢測方法

具有親脂性——在適當?shù)膒H值下用溶劑萃取

具有強極性或親水性——沉淀蛋白、固相萃取、離子對萃取或衍生化后萃取等

具有揮發(fā)性——GC測定法

具有光譜或電化學特性——分析檢測方法

藥物的穩(wěn)定性——萃取濃縮技術(shù)

對酸堿不穩(wěn)定——避免使用強酸或強堿性溶劑

對熱不穩(wěn)定——避免高溫蒸發(fā)溶劑2023/10/156(二)待測藥物的體內(nèi)存在狀態(tài)

與血漿蛋白結(jié)合的強弱及結(jié)合率的高低 ——分離萃取方法

蛋白結(jié)合較強——不宜直接采用溶劑萃取

體內(nèi)濃度高低、代謝過程及其代謝產(chǎn)物 ——分析檢測技術(shù)

濃度較低（尤其有代謝產(chǎn)物共存） ——代謝產(chǎn)物的干擾與特定代謝產(chǎn)物的同時測定 ——采用LC-MS等分析檢測技術(shù)

2023/10/157二、分析測定的目的與要求

藥代動力學——研究藥物在體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄過程 ——血漿濃度隨時間的變化過程；代謝途徑及代謝產(chǎn)物

要求

——同時測定原形藥物和代謝產(chǎn)物

檢測

——寬線性范圍(Cmax～Cmax的1/20)、高靈敏度(10-9g/ml)和高專屬

性(分離能力)(原形藥物及其代謝產(chǎn)物的分離)

方法

——不必強調(diào)方法的簡便、快速； ——大多采用色譜及其脫線或在線聯(lián)用技術(shù)，如HPLC、LC-MS

毒代動力學——確定新化合藥物預(yù)期人用劑量水平與其毒性水平之間的安全范圍2023/10/158三、生物樣品的類型與預(yù)處理方法

生物樣品的類型與預(yù)處理方法——決定分析方法的應(yīng)用

以血漿或血清為分析樣品

蛋白沉淀溶劑萃取 ——分析樣品較為“干凈”，可用HPLC或HPLC-MS檢測

2023/10/159四、實驗室條件

在設(shè)計體內(nèi)藥物分析方法時，還應(yīng)充分考慮到實驗室現(xiàn)有的或有可能在其它實驗室使用的儀器裝備，合理選擇可行的分析方法。2023/10/1510第二節(jié)分析方法

建立的一般步驟一、分析方法的選擇二、分析方法的建立 (一)

檢測條件的篩選 (二)分離條件的篩選2023/10/1511一、分析方法的選擇

體內(nèi)藥物分析方法的設(shè)計

生物樣品中的藥物濃度——決定分析方法的首要因素

生物樣品中藥物或其特定代謝產(chǎn)物的濃度低、樣品量少

——難以通過增加取樣量提高方法靈敏度

——通過選擇適當?shù)姆治龇椒ㄟm應(yīng)樣品分析需求

2023/10/1512二、分析方法的建立分析方法建立之前

查閱文獻資料——充分了解藥物在體內(nèi)的動力學過程，使所擬定的分析方法 ——避免受到代謝產(chǎn)物的干擾適用于實際生物樣品測定2023/10/1513二、分析方法的建立初步擬定分析方法后

進行一系列試驗工作——選擇最佳分析條件

同時驗證分析方法的可行性——確認是否適用于實際生物樣品分析方法的建立和驗證過程——是不可截然劃分的

分析方法的建立步驟第一步：檢測條件的篩選第二步：分離條件的篩選2023/10/1514(一)檢測條件的篩選

標準物質(zhì)

——

照擬定的分析方法(不包括生物基質(zhì)的預(yù)處理)測定

——

確定最佳分析檢測條件(如色譜條件)和檢測靈敏度

HPLC——

調(diào)整檢測器(類型、條件)

色譜柱(型號、牌號、填料性狀與粒經(jīng)、柱長度)

流動相(組分及其配比)及其流速

柱溫、進樣量、內(nèi)標物質(zhì)的濃度及其加入量等

——

使各物質(zhì)具有足夠的方法靈敏度(LOQ)

良好的色譜參數(shù)(n、R、T)

適當?shù)谋Ａ魰r間(tR)2023/10/1515(二)分離條件的篩選

在進行分離條件篩選時，應(yīng)考察生物基質(zhì)中的內(nèi)源性物質(zhì)及代謝產(chǎn)物對分離與檢測的干擾，步驟如下： 1．空白溶劑試驗——溶劑(方法特異性) 2．空白生物基質(zhì)試驗——endogenouscompounds(方法特異性) 3．模擬生物樣品試驗——方法效能指標 4．實際生物樣品測試

——代謝產(chǎn)物(方法特異性)2023/10/15162.空白生物基質(zhì)試驗

空白生物基質(zhì)

(blankbiologicalmatrix)

——如空白血漿考察目標

——生物基質(zhì)中內(nèi)源性物質(zhì)對測定的干擾（方法特異性）

——在待測藥物(或特定的活性代謝物、內(nèi)標物質(zhì)等)的“信號窗”（信號附近的有限范圍）內(nèi)不應(yīng)出現(xiàn)內(nèi)源性物質(zhì)信號2023/10/15173.模擬生物樣品試驗

模擬生物樣品(質(zhì)量控制,QC樣品)——空白生物基質(zhì)中加入待測藥物

考察目標

——方法的線性范圍、精密度與準確度、靈敏度

藥物的萃取回收率等各項技術(shù)指標

——同時進一步檢驗生物基質(zhì)中內(nèi)源性物質(zhì)以及可能共同使用的其他藥物對測定的干擾程度，即方法特異性2023/10/15184.實際生物樣品的測試

空白生物基質(zhì)和模擬生物樣品試驗——確定的分析方法及其條件

——不能完全確認是否適合于實際生物樣品的測定

——藥物在體內(nèi)可能與內(nèi)源性物質(zhì)結(jié)合(如血漿蛋白結(jié)合物)

或代謝生成數(shù)個代謝產(chǎn)物及其進一步的結(jié)合物(或綴合物)

實際生物樣品——確立分析方法后，尚需進行實際生物樣品的測試

考察目標

——代謝產(chǎn)物對藥物、內(nèi)標物質(zhì)的干擾情況

——進一步驗證方法的可行性2023/10/1519第三節(jié)分析方法

驗證的內(nèi)容與要求驗證步驟：首先為分析方法的驗證 ——特異性、精密度與準確度、回收率

定量限與檢測限、溶液穩(wěn)定性

其次為生物基質(zhì)中待測藥物穩(wěn)定性的驗證 ——室溫放置、冷凍（或冷藏）、凍-融循環(huán)2023/10/1520驗證的效能指標與基本要求 1．特異性——避免干擾 2．標準曲線與線性范圍——覆蓋所有濃度范圍 3．準確度——與實際狀況相符 4．精密度——結(jié)果可重現(xiàn) 5．定量限——達到峰濃度的1/10～1/20 6．穩(wěn)定性——確保所有樣品準確測定 7．提取回收率——確保準確度8.基質(zhì)效應(yīng)

2023/10/1521一、方法特異性(專屬性或選擇性)

方法的特異性(specificity) ——系指當有內(nèi)源性物質(zhì)存在時，方法準確測定待測物質(zhì)的能力

比較——待測藥物或其活性代謝產(chǎn)物檢測信號

對照品（或標準品）

空白生物基質(zhì)

模擬生物樣品（空白生物基質(zhì)中添加對照品）

確證——內(nèi)源性物質(zhì)對分析方法有無干擾2023/10/1522二、標準曲線與線性范圍

標準曲線（standardcurve）——calibrationcurveorworkingcurve

標準曲線——用模擬生物樣品建立 ——線性范圍(不包括零點)應(yīng)能覆蓋全部生物樣品中的藥物濃度 ——不能使用外推的方法求算未知生物樣品中的藥物濃度

建立標準曲線所使用的模擬生物樣品 ——應(yīng)使用與待測的含藥生物樣品相同的生物基質(zhì)制備2023/10/1523

標準系列溶液的濃度范圍

至少含5～9個濃度點(不包括零點,即空白) ——可覆蓋全部待測生物樣品中的藥物濃度

如：1、2、5、10、20、50、100(等比梯度模式—比例常數(shù)約為2)

若體內(nèi)平均達峰濃度為50，其1/20為2.5

設(shè)定最高濃度為100，最低濃度為1(個體差異)

實際制備時：500、250、100、50、20、10……2023/10/1524

標準系列模擬生物樣品的制備

空白生物基質(zhì)(如血漿)——加入標準系列溶液適量，渦旋混勻

為防止在標準溶液加入及渦旋混合時造成的損失 ——①先加入標準溶液③ ②再加入空白生物基質(zhì) ③渦旋混勻

①

②2023/10/1525標準曲線的限度要求

藥代動力學或生物利用度研究 ——標準曲線至少包括5個濃度(通常為5～9個濃度,不包括零點)

——最高濃度應(yīng)高于達峰濃度(Cmax)；最低濃度應(yīng)低于Cmax的10%～5%，并應(yīng)為方法的LOQ(非LOD) ——相關(guān)系數(shù)要求

≥0.99(色譜法)

——低濃度點準確度為真實值80%-120%，其余點為85%-115%。

2023/10/1526三、準確度

方法準確度(accuracy) ——系指用該方法測得的生物樣品中待測藥物的濃度與其真實濃度的接近程度 ——應(yīng)使用實際生物樣品測定，但實際生物樣品的濃度是未知的所以，通常使用模擬生物樣品測定

2023/10/1527四、精密度

方法精密度(precision) ——系指每次測定結(jié)果與多次測定的平均值的偏離程度 ——表示該分析方法的可重復性(reproducibility) ——反映分析方法的可操作性，是方法驗證的基本要點之一

實際生物樣品的量有限(如血漿，一般為0.1～2ml) ——使用模擬生物樣品測定

2023/10/15281.表示方法

方法精密度一般用標準偏差(standarddeviation，SD)或相對標準偏差(relativestandarddeviation，RSD)表示

SD= RSD= = ——包括批內(nèi)(within-run或intra-assay)RSD—日內(nèi)(within-day)

和批間(between-run或inter-assay)RSD—日間(between