核酸的生物合成 完整版

核酸的生物合成第一節(jié)DNA的生物合成第二節(jié)RNA的生物合成第三節(jié)基因工程

遺傳信息傳遞的中心法則DNARNA蛋白質(zhì)復(fù)制復(fù)制轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄翻譯?核酸的生物合成一、DNA的復(fù)制第一節(jié)DNA的生物合成

核酸的生物合成復(fù)制(replication)：以親代雙鏈DNA為模板，按照堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則，合成出與親代DNA相同的雙鏈DNA分子的過(guò)程。DNA半保留復(fù)制的實(shí)驗(yàn)依據(jù)含N15-DNA的細(xì)菌培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液

第一代繼續(xù)培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液第二代

DNA生物合成時(shí)，親代DNA解開(kāi)為兩股單鏈，各自作為模板(template)按堿基配對(duì)規(guī)律，合成與模板互補(bǔ)的新鏈。在子代DNA分子的兩條鏈中，一條來(lái)自親代，另一條是新合成的，這種復(fù)制方式稱(chēng)為半保留復(fù)制。半保留復(fù)制的概念半保留復(fù)制的生物學(xué)意義生物的遺傳信息通過(guò)DNA復(fù)制，親代DNA的一條鏈保留在子代DNA分子中，新合成的鏈與親代鏈堿基配對(duì)，從而使生物的遺傳信息穩(wěn)定地進(jìn)行傳遞。DNA復(fù)制除了需要DNA模板，dNTP和Mg2+，還需要：DNA聚合酶Ⅰ、II、Ⅲ、Ⅳ、ⅤDNA解旋酶單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB）拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ、Ⅱ引物酶DNA連接酶二、參與E.ColiDNA復(fù)制的酶類(lèi)及相關(guān)因子第一節(jié)DNA的生物合成

核酸的生物合成（1）

DNA聚合酶Ⅰ多功能酶：①5

聚合酶活性對(duì)復(fù)制和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進(jìn)行填補(bǔ)；②

5

外切酶活性對(duì)復(fù)制中的錯(cuò)誤進(jìn)行校對(duì)，保證復(fù)制準(zhǔn)確性；③5

外切酶活性去除RNA引物和突變堿基。

主要功能是負(fù)責(zé)DNA的損傷修復(fù)。323aa小片段5

核酸外切酶活性大片段/Klenow

片段605

aa5

DNA聚合酶活性

5

核酸外切酶活性N端C端枯草桿菌蛋白酶DNA聚合酶Ⅰ928aa（2）DNA聚合酶II

?具有5

聚合酶活性和

5

外切酶活性，沒(méi)有5

外切酶活性。

?只是在無(wú)polⅠ及polⅢ的情況下暫時(shí)起作用。

?對(duì)模板的特異性不高,參與DNA損傷的修復(fù)。（3）DNA聚合酶III催化E.ColiDNA復(fù)制的關(guān)鍵酶。由10種亞基組成不對(duì)稱(chēng)的聚合體。α，ε，θ亞基組成核心酶單體；α亞基具有5’→3’的聚合酶活性；ε亞基具有3’→5’外切酶活性和堿基選擇功能；θ亞基可刺激ε亞基的外切酶活性。β亞基(DNA夾子)能夾穩(wěn)模板鏈，負(fù)責(zé)將核心酶結(jié)合在DNA雙鏈并沿DNA模板滑動(dòng)。其余亞基統(tǒng)稱(chēng)為γ-復(fù)合物,促進(jìn)全酶的組裝及增強(qiáng)核心酶活性。DNA聚合酶Ⅲ5’→3’聚合活性3’→5’外切核心酶DNA夾子γ-復(fù)合物催化DNA聚合參與DNA損傷修復(fù)損傷修復(fù)切除引物功能2040400分子數(shù)/細(xì)胞－－+5

外切酶活性+++

5

外切酶活性+++5

聚合酶活性IIIIIIE.Coli中的DNA聚合酶E.Coli中的DNA聚合酶Ⅳ、Ⅴ主要參與DNA的修復(fù)。（4）真核生物的DNA聚合酶引物合成。復(fù)制的主要酶。參與DNA的修復(fù)。在復(fù)制過(guò)程中起校讀、修復(fù)和填補(bǔ)缺口的作用。線粒體DNA復(fù)制。DNA-pol

DNA-pol

DNA-pol

DNA-pol

DNA-pol

（5）引物酶(primase)依賴(lài)DNA的RNA聚合酶，?？梢源呋坞xNTP聚合形成小片段RNA，。催化RNA引物的生成，對(duì)于DNA合成是必需的，在大腸桿菌，是dnaG基因的表達(dá)產(chǎn)物。引物（primer）：DNA聚合酶不能從頭合成一條新的DNA鏈，而必須有一段RNA引物（十多個(gè)至數(shù)十個(gè)核苷酸不等），作為DNA復(fù)制的起始點(diǎn)，引物的3’-OH，必須是游離的。引物酶與經(jīng)典的RNA聚合酶不同，對(duì)利福平不敏感。引物酶單獨(dú)存在時(shí)相當(dāng)穩(wěn)定，只有在與有關(guān)蛋白質(zhì)組成復(fù)合體時(shí)才有活性，該復(fù)合體稱(chēng)為引發(fā)體。（6）DNA連接酶（ligase）連接雙鏈DNA中一條鏈上3

-OH末端和相鄰堿基5

-P末端，使二者生成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的DNA鏈連接成一條完整的鏈。HO5’3’3’5’DNA連接酶ATP（NAD+）AMP5’3’5’3’在復(fù)制中起接合雙鏈中單鏈缺口的作用；在DNA修復(fù)、重組中也起縫合缺口作用；是基因工程的重要工具酶之一。DNA連接酶的功能（7）DNA解旋酶(helicase)

位于復(fù)制叉前，利用ATP供能，作用于氫鍵，使DNA雙鏈解開(kāi)成為兩條單鏈，便于DNA聚合酶III和引物酶作用。每解開(kāi)一對(duì)堿基，需消耗2分子ATP。解鏈方向解旋酶

（8）單鏈結(jié)合蛋白

(singlestrandbindingprotein,SSB)在復(fù)制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護(hù)單鏈的完整性（不被核酸酶降解）。SSB（9）DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(topoisomerase)

（9）DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(topoisomerase)

拓?fù)洚悩?gòu)酶作用特點(diǎn)兼有內(nèi)切酶活性和連接酶活性克服解鏈過(guò)程中的打結(jié)、纏繞現(xiàn)象。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ：每次通過(guò)斷裂和連接雙鏈DNA中的一條鏈而改變DNA的拓?fù)洚悩?gòu)（超螺旋）。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ：每次通過(guò)斷裂和連接兩條DNA鏈而改變DNA的拓?fù)洚悩?gòu)（超螺旋）。（一）復(fù)制的起始需要解決三個(gè)問(wèn)題：復(fù)制起始位點(diǎn)的識(shí)別；

DNA解開(kāi)成單鏈，提供模板；合成引物，提供3-OH末端。三、原核生物的DNA生物合成

DNA的復(fù)制可以分為3個(gè)階段：起始、延伸和終止。DNA復(fù)制只能從DNA分子的特定區(qū)域內(nèi)開(kāi)始，此部位稱(chēng)復(fù)制起始點(diǎn)（originofreplication,ori）。DNA復(fù)制從起始點(diǎn)開(kāi)始到終點(diǎn)結(jié)束，DNA上每個(gè)獨(dú)立復(fù)制單位稱(chēng)為復(fù)制子。原核生物每個(gè)DNA分子只有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)，因而只有一個(gè)復(fù)制子；真核生物的每個(gè)DNA分子有多個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)，故含有多個(gè)復(fù)制子。大腸桿菌復(fù)制起始點(diǎn)oriC的結(jié)構(gòu)245bp復(fù)制的起始過(guò)程DnaA蛋白與oriC的9核苷酸重復(fù)序列結(jié)合并打開(kāi)13核苷酸保守序列形成單鏈DNA解旋酶(DnaB蛋白)被運(yùn)送到復(fù)制模板，與模板結(jié)合解旋酶(DnaB)作用于氫鍵，消耗ATP，解開(kāi)雙螺旋變成單鏈單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)與單鏈DNA結(jié)合，避免重新配對(duì)和降解引物酶（DnaG）催化合成最初的RNA引物DNA聚合酶III在RNA引物3’-OH端添加dNMP，合成新鏈3

5

3

5

引物3'HO5'引物酶DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶解旋酶SSB復(fù)制叉（二）復(fù)制的延伸復(fù)制的延伸指在DNA聚合酶III催化下，dNTP以dNMP的方式逐個(gè)加入到引物或新和成的子鏈上，其化學(xué)本質(zhì)是磷酸二酯鍵的不斷生成。

前導(dǎo)鏈后隨鏈復(fù)制過(guò)程簡(jiǎn)圖順著解鏈方向生成的子鏈，復(fù)制是連續(xù)進(jìn)行的這股鏈稱(chēng)為前導(dǎo)鏈(leadingstrand)。另一股鏈因?yàn)閺?fù)制的方向與解鏈方向相反，不能順著解鏈方向連續(xù)延長(zhǎng)，這股不連續(xù)復(fù)制的鏈稱(chēng)為后隨鏈(laggingstrand)。前導(dǎo)鏈連續(xù)復(fù)制而后隨鏈不連續(xù)復(fù)制，就是復(fù)制的半不連續(xù)性。岡崎片段(Okazakifragment)：

?1968年日本生化學(xué)者岡崎用電鏡及放射自顯影技術(shù)，觀察到DNA復(fù)制中出現(xiàn)一些不連續(xù)的片段，將這些不連續(xù)的片段稱(chēng)為岡崎片段。岡崎片段再由DNA連接酶連成一條完整的新鏈。

?原核生物:1000-2000個(gè)核苷酸

?真核生物:100-200個(gè)核苷酸3

5

3

5

3′5′3′5′解鏈方向前導(dǎo)鏈(leadingstrand)后隨鏈(laggingstrand)復(fù)制的半不連續(xù)性3′5′岡崎片段前導(dǎo)鏈后隨鏈復(fù)制叉上的一個(gè)ＤＮＡ聚合酶分子如何實(shí)現(xiàn)兩條鏈的同時(shí)合成？DNA聚合酶IDNA連接酶后隨鏈上不連續(xù)性片段的連接1.去除RNA引物2.填補(bǔ)缺口3.連接切口5

5

335

5

OHP335

5

33（三）復(fù)制的終止(Termination)oriterTus定點(diǎn)起始（OriC），兩個(gè)復(fù)制叉雙向等速進(jìn)行，Ter

終止，半保留、半不連續(xù)復(fù)制。（四）、原核生物復(fù)制的特點(diǎn)oriCTerDNA聚合酶能區(qū)分NTP與dNTP；DNA復(fù)制時(shí)按照堿基配對(duì)規(guī)律進(jìn)行，是遺傳信息能準(zhǔn)確傳代的基本前提；DNA聚合酶具有3’-5’核酸外切酶活性和即時(shí)校對(duì)功能，可以檢測(cè)并消除偶然出現(xiàn)的錯(cuò)誤。RNA引物也是保證復(fù)制忠實(shí)性的因素。細(xì)胞內(nèi)具有完整的DNA修復(fù)機(jī)制，可以校正、修復(fù)新合成DNA中的堿基錯(cuò)誤及DNA損傷。（五）、DNA復(fù)制高保真性的酶學(xué)機(jī)制

DNA復(fù)制的出錯(cuò)率僅為10-10-10-9左右。復(fù)制的特點(diǎn)四、真核生物的DNA生物合成

半保留、半不連續(xù)復(fù)制；多起點(diǎn)復(fù)制，多復(fù)制子岡崎片段長(zhǎng)度100－200nt；DNA復(fù)制的同時(shí)，組裝成新的核小體。oriorioriorioriori五、反轉(zhuǎn)錄以RNA為模板合成DNA的過(guò)程稱(chēng)為反轉(zhuǎn)錄(reversetranscription),催化這一反應(yīng)的酶稱(chēng)為反轉(zhuǎn)錄酶。反轉(zhuǎn)錄酶也需要引物。依賴(lài)RNA的DNA聚合酶核糖核酸酶H依賴(lài)DNA的DNA聚合酶六、DNA的損傷、修復(fù)與突變（一）DNA損傷(DNAdamage)：

泛指一切DNA結(jié)構(gòu)和功能的變化。包括各種突變、堿基的損傷和DNA鏈的斷裂。引發(fā)DNA損傷的因素自發(fā)性:自然錯(cuò)配率約為10-9～10-10

左右。物理因素:如UV、各種輻射。化學(xué)因素:烷化劑、堿基類(lèi)似物、以及其他一些人工合成或環(huán)境中存在的化學(xué)物質(zhì)，這些誘發(fā)突變的化學(xué)物質(zhì),稱(chēng)為致癌劑。生物因素:抗菌素類(lèi)、黃曲霉素和病毒等。紫外照射時(shí)DNA鏈中相鄰嘧啶形成二聚體。（二）DNA突變DNA分子中堿基序列改變，從而導(dǎo)致DNA的復(fù)制及后來(lái)的轉(zhuǎn)錄和翻譯隨之發(fā)生變化。DNA突變分為自發(fā)突變和誘發(fā)突變。突變類(lèi)型：1.置換：一個(gè)或幾個(gè)堿基的替換，又稱(chēng)點(diǎn)突變。

轉(zhuǎn)換：Py被Py替換或者Pu被Pu替換；顛換：Py被Pu替換或者Pu被Py替換。2.

插入：DNA鏈中插入一個(gè)或幾個(gè)堿基；3.缺失：DNA鏈中缺失一個(gè)或幾個(gè)堿基。轉(zhuǎn)換插入缺失野生型基因

-T-C-G-A-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-T-G-A-C-A-T-G-C-

-T-C-G-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-C-G-A-C-A-T-G-C-顛換

-T-C-G-T-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-A-G-A-C-A-T-G-C-

-T-C-G-A-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-T-C-G-A-C-A-T-G-C-

-T-C-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-AT（三）修復(fù)1.光裂合酶修復(fù)：經(jīng)光照射后，光裂合酶修復(fù)嘧啶二聚體。2.切除修復(fù)：主要修復(fù)機(jī)制，在一系列酶作用下切除受損傷部分，以完整的一條鏈為模板，合成出切去的部分，使DNA恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)。3.重組修復(fù)：受損傷部位DNA復(fù)制后留下缺口，在重組酶的作用下，帶缺口的DNA與完整的姐妹染色單體的雙鏈DNA進(jìn)行重組交換。切除修復(fù)動(dòng)畫(huà)一、轉(zhuǎn)錄(transcription)：

以單鏈DNA為模板，NTP為原料，在RNA聚合酶催化下合成RNA的過(guò)程。

第二節(jié)RNA的生物合成

核酸的生物合成轉(zhuǎn)錄僅以DNA一條鏈的某一區(qū)段為模板，這種轉(zhuǎn)錄方式稱(chēng)為不對(duì)稱(chēng)轉(zhuǎn)錄。二、轉(zhuǎn)錄模板：

雙鏈DNA分子中作為模板轉(zhuǎn)錄出RNA的那條鏈，稱(chēng)為模板鏈（反義鏈，負(fù)鏈）；另一條鏈稱(chēng)為編碼鏈（有義鏈、正鏈）。三、RNA聚合酶：

核心酶全酶

起始因子，帶領(lǐng)核心酶識(shí)別啟動(dòng)子與DNA模板結(jié)合聚合酶活性結(jié)合啟動(dòng)子及聚合酶其余組分原核生物只有一種RNA聚合酶。四、轉(zhuǎn)錄過(guò)程：

轉(zhuǎn)錄過(guò)程分為起始、延伸和終止三個(gè)階段：

1.起始：基因上由RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合并確定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的特殊DNA序列稱(chēng)為啟動(dòng)子。-15’3’AATTGCCTGACGTTT***********GACCGT+1編碼鏈5’3’TTAACGGACTGCAAA***********CTGGCA模板鏈ACGUUU***********GACCGU-10區(qū)富含AT，又稱(chēng)為T(mén)ATAbox或Pribnowbox，有助于DNA雙螺旋的局部解鏈；-35區(qū)與轉(zhuǎn)錄起始的辨認(rèn)有關(guān)，并決定啟動(dòng)子的強(qiáng)度。①

RNA聚合酶全酶識(shí)別-35區(qū)，并與啟動(dòng)子結(jié)合；②

在σ亞基作用下從-10區(qū)開(kāi)始解鏈，在DNA鏈上形成轉(zhuǎn)錄泡；③

加入第一個(gè)NTP啟動(dòng)RNA合成。RNA的合成不需要引物。轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程：2.延伸：形成啟動(dòng)子-全酶-NTP三元復(fù)合物后，新的NTP加入，形成磷酸二脂鍵。聚合幾個(gè)核苷酸后，σ亞基從全酶上解離。核心酶沿模板鏈3’→5’的方向移動(dòng)，按照堿基配對(duì)的原則以5’→3’方向合成RNA鏈。E.ColiRNA聚合酶以45個(gè)核苷酸/秒的速度合成RNA。RNA聚合酶缺乏核酸外切酶活性，不具備校對(duì)功能。

3.終止：基因末端終止轉(zhuǎn)錄的一段特殊DNA序列稱(chēng)為終止子。不依賴(lài)ρ-因子的終止子

特點(diǎn)：在轉(zhuǎn)錄終點(diǎn)前有一段富含G-C的回文序列，其下游有6—8個(gè)T。終止子序列被轉(zhuǎn)錄后回文序列形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使聚合酶減慢或暫停RNA合成。發(fā)夾結(jié)構(gòu)之后轉(zhuǎn)錄出一系列U，RNA-DNA雜交鏈中的U-A堿基配對(duì)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，極易被破壞，導(dǎo)致RNA-DNA雜交鏈在終止區(qū)解鏈，RNA聚合酶脫離模板，使轉(zhuǎn)錄終止。依賴(lài)ρ-因子的終止子特點(diǎn)：含回文序列，轉(zhuǎn)錄后也形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，但其中G-C序列少，發(fā)夾結(jié)構(gòu)后也缺乏一系列的U，需要ρ因子的幫助才能終止RNA的合成。聚合酶在終止子暫停，ρ因子借助水解ATP供能，追上聚合酶并利用解旋酶活性使RNA-DNA解鏈，轉(zhuǎn)錄停止。ρ因子六個(gè)亞基組成的蛋白質(zhì)；具有ATP酶活性；具有DNA-RNA解旋酶活性。五、RNA轉(zhuǎn)錄加工：

原核生物mRNA可直接作為翻譯的模板，一般不進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后加工；而rRNA、tRNA原初轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物均為無(wú)功能的前體，必須經(jīng)過(guò)加工、修飾才能成為有功能的分子。轉(zhuǎn)錄后加工包括切除某些核苷酸序列、拼接、形成5’和3’端的特殊結(jié)構(gòu)、堿基修飾、改變糖苷鍵等過(guò)程。1、原核生物中rRNA前體的加工2、tRNA前體分子的加工E.Coli

有60種tRNA,少數(shù)隨rRNA

一起轉(zhuǎn)錄，其余成簇排列，轉(zhuǎn)錄成含有兩個(gè)或多個(gè)tRNA的前體。其加工過(guò)程包括：切除tRNA前體兩端多余的序列；

3’端添加CCA；對(duì)堿基進(jìn)行特殊修飾。酵母酪氨酸t(yī)RNA前體的加工加工六、真核生物中的轉(zhuǎn)錄：

1、轉(zhuǎn)錄與翻譯場(chǎng)所不同真核生物的轉(zhuǎn)錄比原核生物復(fù)雜，主要特征：原核生物中mRNA的轉(zhuǎn)錄與翻譯幾乎同時(shí)進(jìn)行，而真核生物轉(zhuǎn)錄發(fā)生在細(xì)胞核內(nèi)，翻譯發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中。2、RNA聚合酶不同原核生物只有一種RNA聚合酶，而真核生物至少有三種RNA聚合酶。Ⅰ:rRNA(5.8S,18S,28S)；Ⅱ:mRNA,microRNA，對(duì)α-鵝膏蕈堿高度敏感；Ⅲ:tRNA,5sRNA；

Ⅳ:siRNA(植物中)。類(lèi)鬼筆鵝膏3、啟動(dòng)子不同真核生物中不同RNA聚合酶分別有自己的啟動(dòng)子。許多RNA聚合酶Ⅱ識(shí)別的啟動(dòng)子在-25區(qū)有TATAbox。另外，真核生物啟動(dòng)子序列含有許多種類(lèi)、數(shù)量和位置不同的核酸保守序列（順式作用元件，cis-element），決定了基因的表達(dá)特征。4、轉(zhuǎn)錄后RNA加工修飾不同真核生物rRNA及tRNA的轉(zhuǎn)錄加工與原核生物類(lèi)似。真核生物mRNA以單個(gè)基因?yàn)檗D(zhuǎn)錄單位，轉(zhuǎn)錄成單順?lè)醋觤RNA。多數(shù)基因是不連續(xù)的，編碼序列（外顯子，extron）被非編碼序列（內(nèi)含子，intron）分割成若干片段，稱(chēng)為斷裂基因。UTR，untranslatedregion，非翻譯區(qū)編碼序列（外顯子）非編碼序列（內(nèi)含子）5’3’外顯子和內(nèi)含子一起被轉(zhuǎn)錄生成mRNA前體分子，在核內(nèi)加工形成大小不等的中間物，稱(chēng)為核不均一RNA(hnRNA，heterogeneousnuclearRNA)。hnRNA的加工：1.轉(zhuǎn)錄完成之前在5’端加帽子結(jié)構(gòu)(m7G5’ppp5’Np---)；2.在3’末端添加多聚腺苷酸（polyA，150-250）尾巴；3.剪去內(nèi)含子，拼接外顯子；4.鏈內(nèi)特定核苷酸的甲基化（m6A）。

UTR，untranslatedregion，非翻譯區(qū)編碼序列（外顯子）非編碼序列（內(nèi)含子）CAPAAAAAAAAACAPAAAAAAAAA成熟的mRNA1.核苷酸合成抑制劑核苷酸合成代謝底物或中間產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物。

氨基酸類(lèi)似物：Gln－重氮乙酰絲氨酸等；

葉酸類(lèi)似物：FH4－氨基蝶呤等；

堿基和核苷類(lèi)似物：6－巰基嘌呤等。七、核酸合成抑制劑：2.與DNA模板結(jié)合的抑制劑與DNA結(jié)合，使DNA失去模板功能，抑制復(fù)制及轉(zhuǎn)錄。（1）嵌合劑：放線菌素D、溴化乙錠等。（2）烷化劑：氮芥(C5H11Cl2N)；硫芥(C4H8Cl2S)。芥子氣毒氣彈2.作用于聚合酶的抑制劑此類(lèi)抑制劑直接作用于DNA聚合酶或RNA聚合酶。如：利福平（結(jié)合RNA聚合酶β亞基，阻斷轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)）；

曲張霉素（阻斷RNA鏈延伸）；

膦羧基乙酸（抑制DNA