第八章 基因重組蛋白包涵體的復(fù)性

第八章

基因重組蛋白包涵體的分離和復(fù)性

北京化工大學(xué)譚天偉教授重組蛋白的復(fù)性概述包涵體的形成包涵體的分離純化蛋白質(zhì)復(fù)性方法基因重組蛋白包涵體的分離和復(fù)性

包涵體的分離和蛋白質(zhì)復(fù)性隨著基因工程技術(shù)的迅猛發(fā)展，人們可以在外來(lái)宿主細(xì)胞中控制目的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)，從而為臨床和工業(yè)生產(chǎn)提供一些因自然原料缺乏而無(wú)法大量獲得的蛋白質(zhì)多肽產(chǎn)品。迄今為止，人們已經(jīng)成功地實(shí)現(xiàn)了用多種原核、真核表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)基因工程蛋白基因工程表達(dá)產(chǎn)物后處理的特殊性8.1重組蛋白質(zhì)

大腸桿菌的重組菌

有多種可選擇的質(zhì)粒；重組遺傳背景清楚，基因表達(dá)易于控制；蛋白表達(dá)量高（可達(dá)總蛋白50％）；

酵母

易于糖基化和正確形成二硫鍵；表達(dá)產(chǎn)物分泌至胞外，易分離純化；易于大規(guī)模培養(yǎng)和生產(chǎn)

動(dòng)物細(xì)胞

產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)液，易分離純化；重組蛋白活性和天然蛋白一樣；表達(dá)質(zhì)粒易于得到；重組細(xì)胞可以大規(guī)模培養(yǎng)補(bǔ)充：蛋白質(zhì)在E.coli中的表達(dá)E.coli表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)：操作方便遺傳背景清楚廉價(jià)培養(yǎng)基中迅速生長(zhǎng)→發(fā)酵成本低、周期短目的蛋白可獲高水平表達(dá)→E.coli是生產(chǎn)重組蛋白的首選表達(dá)系統(tǒng)，特別是對(duì)那些不需要進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯后修飾（如糖基化）就具有生物活性的基因工程蛋白51％8.2包涵體的形成在大腸桿菌中表達(dá)的基因工程蛋白常常以包涵體的形式沉積于細(xì)胞內(nèi)，表現(xiàn)為無(wú)活性的不溶性聚集物包涵體：外源目的基因在宿主系統(tǒng)中高水平表達(dá)時(shí)，因各種原因?qū)е禄虮磉_(dá)產(chǎn)物的一級(jí)結(jié)構(gòu)（即氨基酸序列）雖然正確，而其高級(jí)結(jié)構(gòu)是錯(cuò)誤的，即：沒(méi)有生物活性的包涵體。包涵體直徑約0.5-1μm，具有很高的密度（約1.3mg/ml），相差顯微鏡下有折光性，呈非水溶性，只溶于高濃度變性劑如尿素、鹽酸胍等。

包涵體形成的幾種可能性研究發(fā)現(xiàn)：低表達(dá)時(shí)很少形成包涵體，表達(dá)量越高越易形成包涵體。1）少量蛋白產(chǎn)生時(shí)是可溶的，表達(dá)量過(guò)高，積聚量超過(guò)其在細(xì)胞內(nèi)溶解度時(shí)沉淀；2）合成速度太快，以至于沒(méi)有足夠的時(shí)間進(jìn)行折疊，二硫鍵不能正確配對(duì)；3）蛋白產(chǎn)生量過(guò)多，所需其他成分(如折疊酶和一系列翻譯后修飾酶及分子伴侶等)不足；4）重組蛋白的氨基酸組成，一般說(shuō)來(lái)含硫氨基酸越多、Pro含量越高越容易形成包涵體。5）重組蛋白所處的環(huán)境：發(fā)酵溫度高時(shí)容易形成包涵體。6）有報(bào)道認(rèn)為，豐富的培養(yǎng)基有利于活性蛋白質(zhì)的表達(dá)，當(dāng)培養(yǎng)條件不佳時(shí)，容易形成包涵體。減少包涵體形成的策略1）降低重組菌的生長(zhǎng)溫度：較低的生長(zhǎng)溫度降低了無(wú)活性聚集體形成的速率和疏水相互作用，從而可減少包涵體的形成。2）添加可促進(jìn)重組蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)的添加劑，如：培養(yǎng)E.coli時(shí)添加乙醇（誘導(dǎo)熱休克蛋白的表達(dá)）、低分子量的巰基或二硫化合物（影響細(xì)胞周質(zhì)的還原態(tài)，從而影響二硫鍵的形成）等。3）供給豐富的培養(yǎng)基，創(chuàng)造最佳培養(yǎng)條件，如供氧、pH等。包涵體形成：有利因素1、包涵體形式表達(dá)的蛋白質(zhì)濃度比較高，有時(shí)甚至可以達(dá)到細(xì)胞總蛋白含量的40%2、重組蛋白質(zhì)以包涵體形式存在→包埋了酶攻擊的位點(diǎn)，可以最大限度地抵抗蛋白質(zhì)酶的攻擊3、分離比可溶蛋白質(zhì)的分離方法簡(jiǎn)便，造價(jià)低，使用簡(jiǎn)單的離心或者過(guò)濾的手段就能使包涵體與宿主細(xì)胞的其他蛋白質(zhì)成分進(jìn)行有效的分離4、有些表達(dá)的外源蛋白質(zhì)對(duì)細(xì)胞有毒性或者致死，大量表達(dá)時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的死亡，最終的細(xì)胞數(shù)量和產(chǎn)物相當(dāng)?shù)停欢w形式的蛋白質(zhì)因喪失了生物活性→高效地表達(dá)包涵體加工流程離心去除細(xì)胞碎片（膜蛋白和脂類等）機(jī)械破碎法包涵體提取如何對(duì)包涵體蛋白進(jìn)行高效體外復(fù)性以獲得活性產(chǎn)品是生物工程產(chǎn)業(yè)化經(jīng)常面臨的一個(gè)難題8.3包涵體的提取、溶解與純化8.3包涵體的提取、溶解與純化①包涵體的提取

細(xì)胞破碎，包涵體的分離②包涵體的洗滌

對(duì)包涵體用Tris-HCl緩沖液反復(fù)洗滌幾次緩沖液通常含有Triton-X100、脫氧膽酸鹽、尿素、PMSF等對(duì)包涵體中含的雜蛋白的洗滌最高可采用5M的尿素

③包涵體的溶解

如5-6M的鹽酸胍或6-8M的尿素，同時(shí)還要加入還原劑，打開(kāi)錯(cuò)配的二硫鍵，如二硫蘇糖醇（DTT）、2-巰基乙醇、DET或半胱氨酸等，pH一般維持在8左右④包涵體的純化

包涵體溶解后可以通過(guò)膜過(guò)濾、RPLC、RP-HPLC、凝膠過(guò)濾、離子交換層析或金屬親和層析等方法實(shí)現(xiàn)表達(dá)蛋白洗滌劑pH人干擾素－3突變體（hIL-3）7M尿素,0.5％TritonX-100未報(bào)道人尿激酶原（Pro-Uk）05MPBS,2%TritonX-1007.5HIV-1Gagp24蛋白1％Triton100X-100未報(bào)道大鼠釉原蛋白（Am）50mMTris-Cl,10mMEDTA100mMNaCl,0.5％TritonX-1008.0抗人結(jié)腸癌單鏈抗體（CL-3）1mg/mlDOC,50mMTE1%TritonX-100未報(bào)道人FLT3配體3M尿素,0.1MTris-Cl8.0重組干擾素（IFN-γ）50mMTris-Cl,100mMNaCl,0.5mMEDTA3M尿素,0.2%TritonX-1008.0人睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（CNTF）STE,2M尿素,0.05％TritonX-1008.0人尿激酶原（Pro-Uk）50mMTris-Cl,5M尿素0.5％TritonX-1007.5血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF165）2MNaCl,0.5％TritonX-1004M尿素未報(bào)道包涵體形成的機(jī)制：

U←→I←→NU：指完全去折疊的狀態(tài)，I：指折疊中間體（也稱融球態(tài)moltenglobulestate）N：指天然的成熟的狀態(tài)8.4重組蛋白的體外復(fù)性蛋白質(zhì)復(fù)性機(jī)理蛋白質(zhì)復(fù)性過(guò)程中，涉及兩種疏水相互作用：一是分子內(nèi)的疏水相互作用→促使蛋白質(zhì)正確折疊二是肽鏈分子間的疏水相互作用→導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子間聚集，形成寡聚體和多聚體→再進(jìn)一步聚集形成沉淀→兩者互相競(jìng)爭(zhēng)，影響蛋白質(zhì)復(fù)性收率?！鷱?fù)性過(guò)程中，抑制肽鏈間的疏水相互作用以防止聚集，是提高復(fù)性收率的關(guān)鍵。伸展態(tài)U中間體I局部肽段先由氫鍵形成一些二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象單元，如α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角等聚集體A天然態(tài)N快慢影響復(fù)性效率的因素1）蛋白質(zhì)本身的性質(zhì)有些蛋白非常容易復(fù)性，如牛胰RNA酶有12對(duì)二硫鍵，在較寬松的條件下復(fù)性效率可以達(dá)到95%以上，而有一些蛋白至今沒(méi)有發(fā)現(xiàn)能夠?qū)ζ溥M(jìn)行復(fù)性的方法如IL-11；一般說(shuō)來(lái)，在優(yōu)化的條件下，大多數(shù)蛋白質(zhì)體外復(fù)性效率在20%左右影響復(fù)性效率的因素2）蛋白質(zhì)的復(fù)性濃度I向N的轉(zhuǎn)化是一級(jí)反應(yīng)，而聚沉是二級(jí)或多級(jí)反應(yīng)聚沉的反應(yīng)速度與蛋白質(zhì)濃度的平方或高次方成正比而復(fù)性反應(yīng)過(guò)程與蛋白質(zhì)濃度的一次方成正比，故濃度越大，聚沉反應(yīng)越明顯?！鷱?fù)性時(shí)蛋白質(zhì)濃度宜低（低濃度時(shí)，獲得的蛋白質(zhì)復(fù)性效率比高濃度要好的多）另一方面濃度過(guò)低又給后處理帶來(lái)不便，一般選擇10－100μg／ml，以避免分子間相互作用力引起聚集。影響復(fù)性效率的因素3）變性劑濃度和復(fù)性時(shí)間在高濃度變性劑存在時(shí)，蛋白質(zhì)主要以U存在（6mol/L鹽酸胍、8mol/LUrea等）；在中間濃度時(shí)（較低濃度的鹽酸胍和Urea），主要以I存在，即能抑制蛋白質(zhì)分子間的疏水相互作用，又不會(huì)妨礙蛋白質(zhì)分子內(nèi)疏水相互作用→A方向被阻止。由于I向N轉(zhuǎn)化是一個(gè)慢的過(guò)程，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在此時(shí)放置較長(zhǎng)的一段時(shí)間，I就可以慢慢地向N轉(zhuǎn)化影響復(fù)性效率的因素4）氧化還原環(huán)境復(fù)性不僅要降低或去除變性劑，同時(shí)必須提供SH-氧化形成S-S的環(huán)境→合適的氧化還原環(huán)境采用配對(duì)的氧化型和還原型巰基物質(zhì)配對(duì)低分子量巰基試劑包括GSSG/GSH、半胱氨酸或巰基乙醇/胱氨酸等。通常還原型巰基物質(zhì)的使用濃度為l~3mmol/L，還原型/氧化型的摩爾比為10：1或5：1。影響復(fù)性效率的因素5）pH和溫度最適宜的復(fù)性pH值應(yīng)大于7.0（一般8.0-9.0），以防止自由SH-的質(zhì)子化作用影響正確配對(duì)的S-S的形成。

應(yīng)避免在蛋白質(zhì)pI處進(jìn)行復(fù)性（蛋白質(zhì)的靜電排斥力幾乎為零，相互間疏水作用區(qū)域就容易作用而形成A）。溫度過(guò)高，蛋白質(zhì)的聚集將十分嚴(yán)重，低溫下聚集和折疊反應(yīng)都很慢，隨著溫度的上升二者的速度都加快→常在室溫下進(jìn)行影響復(fù)性效率的因素6）折疊促進(jìn)劑

能夠促進(jìn)蛋白再折疊的化學(xué)物質(zhì)統(tǒng)稱為折疊促進(jìn)劑，折疊促進(jìn)劑的作用原理在于穩(wěn)定復(fù)性蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)、抑制肽鏈間的疏水相互作用。應(yīng)用于蛋白質(zhì)復(fù)性并具有顯著效果的折疊促進(jìn)劑有表面活性劑、聚乙二醇PFG、L－精氨酸、抗體、分子伴侶等。

包涵體的分離和蛋白質(zhì)的復(fù)性由于蛋白質(zhì)的多樣性、結(jié)構(gòu)和折疊過(guò)程的復(fù)雜性，使得人們不能對(duì)一種復(fù)性方法進(jìn)行簡(jiǎn)單的移植，也很難找到具有普適性而又低成本的高效復(fù)性方法。實(shí)際操作過(guò)程中必須針對(duì)每種目標(biāo)蛋白的特點(diǎn)對(duì)影響復(fù)性的各個(gè)因素逐一優(yōu)化才能最終確定適用于該種蛋白質(zhì)的復(fù)性方法一般說(shuō)來(lái)，在優(yōu)化的條件下，大多數(shù)蛋白質(zhì)體外復(fù)性效率在20%左右重組蛋白再折疊的方法稀釋法抗體協(xié)助的再折疊分子伴侶介導(dǎo)的再折疊反向微團(tuán)利用雙水相體系進(jìn)行再折疊色