專題32基因工程（串講）

專題32基因工程考點(diǎn)分布重點(diǎn)難點(diǎn)備考指南1.基因工程的誕生2.基因工程的原理及技術(shù)（含PCR技術(shù)）理解掌握質(zhì)粒的類型和特點(diǎn)。理解并掌握基因工程用的兩種酶的作用。理解掌握基因工程的操作步驟和注意事項(xiàng)。掌握蛋白質(zhì)工程的流程考點(diǎn)一基因工程的操作工具1．基因工程的概念基因工程是指按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)，并通過(guò)體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，因此又叫做DNA重組技術(shù)。基因工程的變異原理是基因重組。2．基因工程的基本工具(1)限制性內(nèi)切核酸酶（簡(jiǎn)稱限制酶）。主要來(lái)自原核生物。具有專一性，斷裂特定的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵。產(chǎn)生黏性末端或平末端①原核生物中存在限制酶的意義是什么？原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保證自身安全，防止外來(lái)病原物的危害。②限制酶來(lái)源于原核生物，為什么不能切割自己的DNA分子？限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在該酶的識(shí)別序列或識(shí)別序列已經(jīng)被修飾。(2)DNA連接酶①作用：將限制酶切割下來(lái)的DNA片段拼接成新的DNA分子，恢復(fù)被限制酶切開(kāi)的兩個(gè)脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵。②類型常用類型E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶來(lái)源大腸桿菌T4噬菌體特點(diǎn)只縫合黏性末端縫合黏性末端和平末端DNA連接酶和DNA聚合酶不是一回事。原因是：①DNA連接酶連接的是兩個(gè)DNA片段，而DNA聚合酶是把單個(gè)的脫氧核苷酸連接到已有的DNA片段上。②DNA聚合酶起作用時(shí)需要以一條DNA鏈為模板，而DNA連接酶不需要模板。(3)載體①種類：質(zhì)粒、動(dòng)植物病毒、噬菌體等。②質(zhì)粒的特點(diǎn)：有一個(gè)或多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)、能自我復(fù)制、有特殊的標(biāo)記基因。③運(yùn)載體的作用：攜帶外源DNA片段進(jìn)入受體細(xì)胞。1．與DNA有關(guān)的酶的比較名稱作用部位作用結(jié)果限制酶磷酸二酯鍵將DNA切成兩個(gè)片段DNA連接酶磷酸二酯鍵將兩個(gè)DNA片段連接為一個(gè)DNA分子DNA聚合酶磷酸二酯鍵將單個(gè)脫氧核苷酸依次連接到單鏈末端DNA（水解）酶磷酸二酯鍵將DNA片段水解為單個(gè)脫氧核苷酸解旋酶堿基對(duì)之間的氫鍵將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈(1)不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇PstⅠ，而不選擇SmaⅠ。(2)保留標(biāo)記基因原則：質(zhì)粒作為載體必須具備標(biāo)記基因，所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中不選擇SmaⅠ。(3)確保出現(xiàn)相同黏性末端原則：通常選擇與切割目的基因相同的限制酶，如圖甲中PstⅠ；為避免目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖甲也可選擇PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶。載體上標(biāo)記基因的作用載體上的標(biāo)記基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要轉(zhuǎn)入的受體細(xì)胞沒(méi)有抵抗相關(guān)抗生素的能力。當(dāng)含有抗生素抗性基因的載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，抗性基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，使受體細(xì)胞能夠抵抗相應(yīng)抗生素，所以在受體細(xì)胞的培養(yǎng)體系中加入該種抗生素就可以只保留轉(zhuǎn)入載體的受體細(xì)胞，原理如下圖所示：典例1.下列有關(guān)基因工程中載體的說(shuō)法，正確的是()A．在進(jìn)行基因工程操作中，被用作載體的質(zhì)粒都是天然質(zhì)粒B．所有的質(zhì)粒都可以作為基因工程中的載體C．質(zhì)粒是一種獨(dú)立于細(xì)菌染色體外的鏈狀DNA分子D．作為載體的質(zhì)粒DNA分子上應(yīng)有對(duì)重組DNA進(jìn)行鑒定和選擇的標(biāo)記基因【答案】D【解析】在進(jìn)行基因工程操作中，被用作載體的質(zhì)粒是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行過(guò)人工改造的，A錯(cuò)誤；具有一至多個(gè)限制酶切點(diǎn)、具有標(biāo)記基因的質(zhì)粒才可以作為基因工程中的載體，B錯(cuò)誤；質(zhì)粒是一種獨(dú)立于細(xì)菌擬核DNA外的環(huán)狀DNA分子，C錯(cuò)誤；作為載體的質(zhì)粒DNA分子上應(yīng)有對(duì)重組DNA進(jìn)行鑒定和選擇的標(biāo)記基因，而且能在受體細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定保存，D正確。典例2.如圖是將乙肝病毒表面主蛋白基因HBsAg導(dǎo)入巴斯德畢赤酵母菌生產(chǎn)乙肝疫苗的過(guò)程圖。巴斯德畢赤酵母菌是一種甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母，能將甲醇作為其唯一碳源。該酵母菌體內(nèi)無(wú)天然質(zhì)粒，科學(xué)家改造出了圖1所示的pPIC9K質(zhì)粒用作載體，其與目的基因形成的重組質(zhì)粒經(jīng)酶切后可以與酵母菌染色體發(fā)生同源重組，將目的基因整合于染色體中以實(shí)現(xiàn)表達(dá)。已知當(dāng)甲醇作為唯一碳源時(shí)，該酵母菌中AOX1基因受到誘導(dǎo)而表達(dá)[5′AOX1和3′AOX1(TT)分別是基因AOX1的啟動(dòng)子和終止子]。請(qǐng)分析回答下列問(wèn)題：(1)為實(shí)現(xiàn)HBsAg基因和pPIC9K質(zhì)粒重組，應(yīng)該選擇切割質(zhì)粒，并在HBsAg基因兩側(cè)的A和B位置接上，這樣設(shè)計(jì)的優(yōu)點(diǎn)是。(2)酶切獲取HBsAg基因后，需用將其連接到pPIC9K質(zhì)粒上，形成重組質(zhì)粒，并將其導(dǎo)入大腸桿菌以獲取。(3)步驟3中應(yīng)選用限制酶來(lái)切割重組質(zhì)粒以獲得重組DNA，然后再將其導(dǎo)入巴斯德畢赤酵母菌細(xì)胞。(4)為了確認(rèn)巴斯德畢赤酵母菌轉(zhuǎn)化是否成功，在培養(yǎng)基中應(yīng)該加入以便篩選；若要檢測(cè)轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞中是否含有HBsAg基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，可以用方法進(jìn)行檢測(cè)。(5)轉(zhuǎn)化的酵母菌在培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時(shí)間后，需要向其中加入以維持其生活，同時(shí)誘導(dǎo)HBsAg基因表達(dá)?！敬鸢浮?1)SnaBⅠ和AvrⅡ相應(yīng)的限制酶識(shí)別序列確保定向連接(或避免質(zhì)粒和目的基因自身環(huán)化及反向連接)(2)DNA連接酶大量重組質(zhì)粒(3)BglⅡ(4)卡拉霉素分子雜交(5)甲醇【解析】(1)圖中質(zhì)粒含有SnaBⅠ、AvrⅡ、BglⅡ、SacⅠ4種限制酶切割位點(diǎn)，其中SacⅠ位于啟動(dòng)子上，BglⅡ位于終止子上。如果將HBsAg基因和pPIC9K質(zhì)粒重組，只能用限制酶SnaBⅠ和AvrⅡ切割質(zhì)粒，所以應(yīng)在HBsAg基因兩側(cè)的A和B位置接上SnaBⅠ、AvrⅡ限制酶的識(shí)別序列。這兩種限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端不同，這樣可以避免質(zhì)粒和目的基因自身環(huán)化，還可以防止目的基因和質(zhì)粒反向連接。(2)獲取目的基因后，需要用DNA連接酶將目的基因和載體連接形成重組質(zhì)粒，并將其導(dǎo)入大腸桿菌以獲取大量重組質(zhì)粒。(3)步驟3是要獲取含有5′AOX1－3′AOX1段基因，應(yīng)選用限制酶BglⅡ來(lái)切割重組質(zhì)粒獲得重組DNA，然后將其導(dǎo)入巴斯德畢赤酵母菌細(xì)胞。(4)5′AOX1－3′AOX1段基因含有卡拉霉素抗性基因，因此在培養(yǎng)基中加入卡拉霉素以便篩選導(dǎo)入重組質(zhì)粒的目的菌。檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄應(yīng)該用分子雜交技術(shù)。(5)巴斯德畢赤酵母菌是一種甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母菌，能將甲醇作為其唯一碳源，同時(shí)甲醇能誘導(dǎo)AOX1基因表達(dá)。所以轉(zhuǎn)化的酵母菌在培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時(shí)間后，需要向其中加入甲醇以維持其生活，同時(shí)誘導(dǎo)HBsAg基因表達(dá)?？键c(diǎn)二基因工程的基本操作程序1．目的基因的獲取(1)目的基因：主要指編碼蛋白質(zhì)的基因，也可以是一些具有調(diào)控作用的因子。(2)獲取目的基因的方法利用PCR技術(shù)獲取和擴(kuò)增目的基因。原理：DNA雙鏈復(fù)制。過(guò)程第一步：變性加熱至90℃以上，DNA解鏈為單鏈；第二步：復(fù)性冷卻至50℃左右，引物結(jié)合到互補(bǔ)DNA鏈；第三步：延伸加熱至72℃左右，Taq酶從引物起始進(jìn)行互補(bǔ)鏈的合成。如此重復(fù)循環(huán)多次。2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建——基因工程的核心①目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。②基因表達(dá)載體的組成：目的基因、復(fù)制原點(diǎn)、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因。啟動(dòng)子≠起始密碼子，終止子≠終止密碼子（1）啟動(dòng)子：一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的首端。它是RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄。（2）終止子：一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA短片段，位于基因的尾端。作用是終止轉(zhuǎn)錄。（3）起始密碼子和終止密碼子位于mRNA上，分別控制翻譯過(guò)程的啟動(dòng)和終止。生物種類植物動(dòng)物微生物常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法顯微注射技術(shù)感受態(tài)細(xì)胞法受體細(xì)胞體細(xì)胞或受精卵受精卵原核細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程將目的基因插入到Ti質(zhì)粒的T-DNA上→農(nóng)桿菌→導(dǎo)入植物細(xì)胞→整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上→表達(dá)將含有目的基因的表達(dá)載體提純→取卵（受精卵）→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動(dòng)物Ca2＋處理細(xì)胞→感受態(tài)細(xì)胞→重組表達(dá)載體DNA分子與感受態(tài)細(xì)胞混合→感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子（4）目的基因的檢測(cè)與鑒定利用PCR技術(shù)檢測(cè)染色體DNA上是否插入了目的基因和是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA，用抗原-抗體雜交法，檢測(cè)目的基因是否翻譯成了相應(yīng)的蛋白質(zhì)。1.構(gòu)建基因表達(dá)載體的目的是使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。一個(gè)基因表達(dá)載體的組成包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子及標(biāo)記基因等。圖中抗生素抗性基因的作用是作為標(biāo)記基因，鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)。(1)關(guān)于引物的2點(diǎn)提醒：①引物是一小段單鏈的DNA或RNA，作為新子鏈的合成起點(diǎn)，只能結(jié)合在母鏈的3′端；②只有通過(guò)引物，DNA才可以開(kāi)始進(jìn)行復(fù)制。(2)PCR技術(shù)和DNA復(fù)制的比較3．基因表達(dá)載體構(gòu)建過(guò)程若考慮兩兩相連，則DNA連接酶連接DNA片段會(huì)出現(xiàn)三種情況：目的基因與目的基因的連接、目的基因與質(zhì)粒的連接、質(zhì)粒與質(zhì)粒的連接，需篩選出重組質(zhì)粒。1.目的基因的插入位點(diǎn)不是隨意的：基因表達(dá)需要啟動(dòng)子與終止子的調(diào)控，所以目的基因的插入位點(diǎn)應(yīng)在啟動(dòng)子與終止子之間。2．受體細(xì)胞選擇時(shí)需注意：要合成糖蛋白、有生物活性的胰島素必須用真核生物酵母菌（需內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體的加工、分泌）；一般不用支原體，因?yàn)樗鼱I(yíng)寄生生活；一定不能用哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞，因?yàn)樗鼰o(wú)細(xì)胞核，不能合成蛋白質(zhì)。典例1.土壤農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時(shí)，Ti質(zhì)粒上的T－DNA片段轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞的基因組中。利用農(nóng)桿菌以Ti質(zhì)粒作為載體進(jìn)行轉(zhuǎn)基因，下列相關(guān)敘述正確的是()A．目的基因應(yīng)插入T－DNA片段外，以防止破壞T－DNAB．用Ca2＋處理農(nóng)桿菌，以利于其侵染植物細(xì)胞C．Ti質(zhì)粒是一種環(huán)狀DNA分子，屬于細(xì)菌的擬核DNAD．T－DNA片段有利于介導(dǎo)外源DNA整合到植物細(xì)胞的染色體上【答案】D【解析】目的基因應(yīng)插入T－DNA片段上，通過(guò)農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化作用，使目的基因進(jìn)入植物細(xì)胞；若受體細(xì)胞為微生物，常采用Ca2＋處理，使微生物細(xì)胞成為感受態(tài)細(xì)胞；Ti質(zhì)粒分布在細(xì)菌擬核DNA之外；T－DNA有助于外源DNA片段整合到植物細(xì)胞的染色體上。典例2.乙肝病毒是一種DNA病毒。中國(guó)的乙肝病毒攜帶者約占總?cè)丝诘?0%。我國(guó)科學(xué)家通過(guò)基因工程生產(chǎn)出乙型肝炎病毒疫苗，為預(yù)防乙肝提供了有力的保障?；卮鹣铝袉?wèn)題：（1）乙肝病毒專一侵染肝細(xì)胞的原因是________________________________________。（2）乙肝病毒的基因組可編碼的蛋白質(zhì)及功能如下：Core蛋白是外殼蛋白；Pre－core與抑制宿主的免疫反應(yīng)有關(guān)；X蛋白與病毒復(fù)制有關(guān)；S蛋白是病毒的包膜蛋白，與病毒進(jìn)入細(xì)胞有關(guān)。通過(guò)基因工程生產(chǎn)的乙肝疫苗的有效成分是上述病毒蛋白中的____________________。（3）通過(guò)基因工程生產(chǎn)乙肝疫苗的過(guò)程如圖所示：乙肝病毒eq\o(→,\s\up11(①),\s\do4(分離))有關(guān)基因eq\o(→,\s\up11(②),\s\do4(導(dǎo)入))細(xì)菌eq\f(③,發(fā)酵)大量生產(chǎn)疫苗a．若要獲得大量的目的基因，可采用PCR技術(shù)進(jìn)行體外擴(kuò)增，該技術(shù)中使用的引物有________種，其作用是________________________。b．在①②過(guò)程中需使用的工具酶是________________。②過(guò)程中常用的載體是________。c．為提高②過(guò)程的轉(zhuǎn)化效率，常采用的方法是______________________________。（4）使用酵母菌作為受體菌生產(chǎn)乙肝疫苗的效果更好，從細(xì)胞結(jié)構(gòu)的角度分析，原因是________________________________________________________________________?！敬鸢浮浚?）肝細(xì)胞表面有乙肝病毒的受體（2）Core蛋白和S蛋白（3）a.2使熱穩(wěn)定的DNA聚合酶能夠從引物的結(jié)合端開(kāi)始連接脫氧核苷酸b．限制酶和DNA連接酶質(zhì)粒c．用Ca2＋（CaCl2）溶液處理細(xì)菌（4）酵母菌具有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體，可以對(duì)核糖體合成的肽鏈進(jìn)行剪切、折疊、加工、修飾等處理【解析】（1）由于肝細(xì)胞表面有乙肝病毒的受體，所以乙肝病毒專一侵染肝細(xì)胞。（2）根據(jù)題意分析，乙肝病毒作為抗原的部分應(yīng)該是其外殼蛋白和包膜蛋白，即通過(guò)基因工程生產(chǎn)的乙肝疫苗的有效成分是上述病毒蛋白中的Core蛋白和S蛋白。（3）a.PCR技術(shù)中，需要2種不同的引物，使DNA聚合酶能夠從引物的結(jié)合端開(kāi)始連接脫氧核苷酸。b．在構(gòu)建基因表達(dá)載體的過(guò)程中，需要使用的工具酶是限制酶和DNA連接酶，常用的載體是質(zhì)粒。c．為了提高將重組質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)菌的轉(zhuǎn)化效率，常用Ca2＋（CaCl2）溶液處理細(xì)菌，使之成為感受態(tài)細(xì)胞。（4）酵母菌具有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體，可以對(duì)核糖體合成的肽鏈進(jìn)行剪切、折疊、加工、修飾等處理，因此使用酵母菌作為受體菌生產(chǎn)乙肝疫苗的效果更好?？键c(diǎn)三基因工程的應(yīng)用和蛋白質(zhì)工程表現(xiàn)方面具體內(nèi)容農(nóng)牧業(yè)方面①轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)植物；②轉(zhuǎn)基因抗病植物；③轉(zhuǎn)基因抗除草劑植物；④利用轉(zhuǎn)基因改良植物品質(zhì)⑤提高動(dòng)物的生長(zhǎng)速率⑥改善畜產(chǎn)品的品質(zhì)醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域①生產(chǎn)藥物②建立器官移植的工廠食品工業(yè)方面利用基因工程菌生產(chǎn)食品工業(yè)用酶、氨基酸、維生素等；將牛凝乳酶的基因?qū)胛⑸?，生產(chǎn)凝乳酶；2．蛋白質(zhì)工程(1)概念①基礎(chǔ)：蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系。②手段：改造基因或基因合成。③結(jié)果：對(duì)現(xiàn)有蛋白質(zhì)進(jìn)行改造或制造出新的蛋白質(zhì)。1.對(duì)天然蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，你認(rèn)為應(yīng)該直接對(duì)蛋白質(zhì)分子進(jìn)行操作，還是通過(guò)對(duì)基因的操作來(lái)實(shí)現(xiàn)？原因是什么？應(yīng)該通過(guò)對(duì)基因的操作來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)天然蛋白質(zhì)的改造。主要原因有：①蛋白質(zhì)具有十分復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)，基因的結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，容易改造；②改造后的基因可以遺傳給下一代，被改造的蛋白質(zhì)無(wú)法遺傳。（1）區(qū)別項(xiàng)目蛋白質(zhì)工程基因工程過(guò)程預(yù)期蛋白質(zhì)的功能→設(shè)計(jì)預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)→推測(cè)應(yīng)有的氨基酸序列→找到相對(duì)應(yīng)的脫氧核苷酸序列獲取目的基因→基因表達(dá)載體的構(gòu)建→將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞→目的基因的檢測(cè)與鑒定實(shí)質(zhì)定向改造或生產(chǎn)人類所需的蛋白質(zhì)定向改造生物的遺傳特性，以獲得人類所需的生物類型和生物產(chǎn)品結(jié)果可生產(chǎn)自然界沒(méi)有的蛋白質(zhì)只能生產(chǎn)自然界已有的蛋白質(zhì)（2）聯(lián)系①蛋白質(zhì)工程是在基因工程的基礎(chǔ)上，延伸出來(lái)的第二代基因工程。②基因工程中所利用的某些酶需要通過(guò)蛋白質(zhì)工程進(jìn)行修飾、改造。(1)青霉素是青霉菌產(chǎn)生的，不是通過(guò)基因工程產(chǎn)生的。(2)動(dòng)物基因工程主要是為了改善畜產(chǎn)品的品質(zhì)，而不是為了產(chǎn)生體型巨大的個(gè)體。(3)原核生物的基因(如抗蟲(chóng)基因)可以作為真核生物(棉花)的目的基因。(4)Bt毒蛋白基因產(chǎn)生的Bt毒蛋白只在某些昆蟲(chóng)腸道的堿性環(huán)境中才能表現(xiàn)出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，腸道細(xì)胞也無(wú)特異性受體，因此，Bt毒蛋白不會(huì)對(duì)人畜產(chǎn)生危害。典例1.紅細(xì)胞生成素(EPO)是體內(nèi)促進(jìn)紅細(xì)胞生成的一種激素物質(zhì)，是當(dāng)今最成功的基因工程藥物，可用于治療腎衰性貧血等疾病。由于天然EPO來(lái)源極為有限，目前臨床使用的紅細(xì)胞生成素主要來(lái)自基因工程技術(shù)生產(chǎn)的重組人紅細(xì)胞生成素(rhEPO)。其簡(jiǎn)要生產(chǎn)流程如圖，下列相關(guān)敘述正確的是()A．過(guò)程①用到的工具酶有DNA聚合酶、限制酶和DNA連接酶B．構(gòu)建的重組表達(dá)載體中終止子的作用是終止翻譯過(guò)程C．檢測(cè)重組細(xì)胞是否表達(dá)出rhEPO常用抗原—抗體雜交技術(shù)D．用乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)EPO可將人EPO基因?qū)氩溉閯?dòng)物體細(xì)胞獲得【答案】C【解析】過(guò)程①構(gòu)建基因的表達(dá)載體，需用限制酶切割目的基因和載體，并用DNA連接酶連接，該過(guò)程無(wú)需DNA聚合酶參與，A錯(cuò)誤；終止子的作用是終止轉(zhuǎn)錄過(guò)程，B錯(cuò)誤；檢測(cè)重組細(xì)胞是否表達(dá)出rhEPO，可利用抗原—抗體特異性結(jié)合的原理，采用抗原—抗體雜交技術(shù)檢測(cè)，C正確；采用細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)EPO成本比較高，可以采用乳腺生物反應(yīng)器，將基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)入雌性哺乳動(dòng)物受精卵中，使EPO基因在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的乳腺細(xì)胞中表達(dá)，通過(guò)分泌的乳汁來(lái)生產(chǎn)EPO，目前還不能直接用高度分化的體細(xì)胞克隆哺乳動(dòng)物，D錯(cuò)誤。典例2.甜蛋白是一種高甜度的特殊蛋白質(zhì)。為了改善黃瓜的品質(zhì)，科學(xué)家采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將一種甜蛋白基因成功導(dǎo)入黃瓜細(xì)胞，得到了轉(zhuǎn)基因植株。回答下列問(wèn)題：(1)用農(nóng)桿菌感染時(shí)，應(yīng)優(yōu)先選用黃瓜(填“受傷的”或“完好的”)葉片與含重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌共同培養(yǎng)，選用這種葉片的理由是。(2)若在轉(zhuǎn)基因黃瓜中檢測(cè)到這種甜蛋白，則表明該重組質(zhì)粒中的已轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中且能夠表達(dá)；用該轉(zhuǎn)基因黃瓜的某一植株與一株非轉(zhuǎn)基因植株雜交，發(fā)現(xiàn)子代中含甜蛋白個(gè)體數(shù)與不含甜蛋白個(gè)體數(shù)之比為1∶1，則說(shuō)明甜蛋白基因已經(jīng)整合到(填“核基因組”“線粒體基因組”或“葉綠體基因組”)中。(3)假設(shè)某種轉(zhuǎn)基因作物因?yàn)槭艿讲《靖腥径鴾p產(chǎn)，若要以該轉(zhuǎn)基因作物為材料獲得脫毒苗，應(yīng)選用作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)。(4)通常，基因工程操作主要有4個(gè)步驟，即目的基因的獲取、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞、目的基因的檢測(cè)與鑒定。因此，基因工程的含義可概括為?！敬鸢浮?1)受傷的葉片傷口處的細(xì)胞會(huì)分泌大量的酚類化合物，可吸引農(nóng)桿菌移向這些細(xì)胞(2)甜蛋白基因核基因組(3)莖尖(4)按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)，并通過(guò)體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品【解析】(1)農(nóng)桿菌能在自然條件下感染雙子葉植物和裸子植物，當(dāng)植物體受到損傷時(shí)，傷口處的細(xì)胞會(huì)分泌大量的酚類化合物，吸引農(nóng)桿菌移向這些細(xì)胞，這時(shí)農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒上的T－DNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，并且整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。所以選擇受傷的黃瓜葉片與含重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌共同培養(yǎng)。(2)甜蛋白基因是目的基因，若在轉(zhuǎn)基因黃瓜中檢測(cè)到該甜蛋白，表明該重組質(zhì)粒中的甜蛋白基因已轉(zhuǎn)移至植物細(xì)胞中且能夠表達(dá)；非轉(zhuǎn)基因植株無(wú)甜蛋白基因，用OO表示，與轉(zhuǎn)基因黃瓜(用AO表示)的某一植株雜交，子代含甜蛋白個(gè)體數(shù)與不含甜蛋白個(gè)體數(shù)之比為1∶1，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因黃瓜是雜合子，且甜蛋白基因整合到核基因組中。(3)植物分生區(qū)附近(如莖尖)的病毒含量少，甚至無(wú)病毒，利用其作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，可獲得脫毒苗。1．限制酶是一類酶，而不是一種酶。2．將一個(gè)基因從DNA分子上切割下來(lái)，需要切兩處，同時(shí)產(chǎn)生四個(gè)黏性末端或平末端。3．不同DNA分子用同一種限制酶切割，產(chǎn)生的末端都相同，同一個(gè)DNA分子用不同的限制酶切割，產(chǎn)生的末端一般不相同。4．限制酶切割位點(diǎn)應(yīng)位于標(biāo)記基因之外，不能破壞標(biāo)記基因，以便進(jìn)行檢測(cè)。1.（2023·浙江·統(tǒng)考高考真題）紫外線引發(fā)的DNA損傷，可通過(guò)“核苷酸切除修復(fù)（NER）”方式修復(fù)，機(jī)制如圖所示。著色性干皮癥（XP）患者的NER酶系統(tǒng)存在缺陷，受陽(yáng)光照射后，皮膚出現(xiàn)炎癥等癥狀?；颊哂啄臧l(fā)病，20歲后開(kāi)始發(fā)展成皮膚癌。下列敘述錯(cuò)誤的是（）

A．修復(fù)過(guò)程需要限制酶和DNA聚合酶B．填補(bǔ)缺口時(shí)，新鏈合成以5’到3’的方向進(jìn)行C．DNA有害損傷發(fā)生后，在細(xì)胞增殖后進(jìn)行修復(fù)，對(duì)細(xì)胞最有利D．隨年齡增長(zhǎng)，XP患者幾乎都會(huì)發(fā)生皮膚癌的原因，可用突變累積解釋【答案】C【解析】A、由圖可知，修復(fù)過(guò)程中需要將損傷部位的序列切斷，因此需要限制酶的參與；同時(shí)修復(fù)過(guò)程中，單個(gè)的脫氧核苷酸需要依次連接，要借助DNA聚合酶，A正確；B、填補(bǔ)缺口時(shí)，新鏈即子鏈的延伸方向?yàn)?’到3’的方向進(jìn)行，B正確；C、DNA有害損傷發(fā)生后，在細(xì)胞增殖中進(jìn)行修復(fù)，保證DNA復(fù)制的正確進(jìn)行，對(duì)細(xì)胞最有利，C錯(cuò)誤；D、癌癥的發(fā)生是多個(gè)基因累積突變的結(jié)果，隨年齡增長(zhǎng)，XP患者幾乎都會(huì)發(fā)生皮膚癌的原因，可用突變累積解釋，D正確。故選C。2.（2023·湖南·統(tǒng)考高考真題）鹽堿脅迫下植物應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生的H2O2對(duì)細(xì)胞有毒害作用。禾本科農(nóng)作物AT1蛋白通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞膜上PIP2s蛋白磷酸化水平，影響H2O2的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，如圖所示。下列敘述錯(cuò)誤的是（

）

A．細(xì)胞膜上PIP2s蛋白高磷酸化水平是其提高H2O2外排能力所必需的B．PIP2s蛋白磷酸化被抑制，促進(jìn)H2O2外排，從而減輕其對(duì)細(xì)胞的毒害C．敲除AT1基因或降低其表達(dá)可提高禾本科農(nóng)作物的耐鹽堿能力D．從特殊物種中發(fā)掘逆境脅迫相關(guān)基因是改良農(nóng)作物抗逆性的有效途徑【答案】B【解析】A、由題圖右側(cè)的信息可知，AT1蛋白缺陷，可以促進(jìn)PIP2s蛋白的磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)H2O2排出膜外，A正確；B、據(jù)題圖左側(cè)的信息可知，AT1蛋白能夠抑制PIP2s蛋白的磷酸化，減少了H2O2從細(xì)胞內(nèi)輸出到細(xì)胞外的量，導(dǎo)致抗氧化脅迫能力弱，不能減輕其對(duì)細(xì)胞的毒害，B錯(cuò)誤；C、結(jié)合對(duì)A選項(xiàng)的分析可推測(cè)，敲除AT1基因或降低其表達(dá)，可提高禾本科農(nóng)作物抗氧化脅迫的能力，進(jìn)而提高其成活率，C正確；D、從特殊物種中發(fā)掘逆境脅迫相關(guān)基因，可通過(guò)基因工程技術(shù)改良農(nóng)作物抗逆性，D正確。故選B。3.（2023·湖北·統(tǒng)考高考真題）用氨芐青霉素抗性基因（AmpR）、四環(huán)素抗性基因（TetR）作為標(biāo)記基因構(gòu)建的質(zhì)粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質(zhì)粒，構(gòu)建基因表達(dá)載體（重組質(zhì)粒），并轉(zhuǎn)化到受體菌中。下列敘述錯(cuò)誤的是（）

A．若用HindⅢ酶切，目的基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四環(huán)素）培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因C．若用SphⅠ酶切，可通過(guò)DNA凝膠電泳技術(shù)鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否D．若用SphⅠ酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Amp（氨芐青霉素）和Tet的培養(yǎng)基中能形成菌落【答案】D【解析】A、若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同，A正確。B、若用PvuⅠ酶切，重組質(zhì)粒和質(zhì)粒中都有四環(huán)素抗性基因（TetR），因此在含Tet（四環(huán)素）培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因，B正確；C、DNA凝膠電泳技術(shù)可以分離不同大小的DNA片段，重組質(zhì)粒的大小與質(zhì)粒不同，能夠鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否，C正確；D、SphⅠ的酶切位點(diǎn)位于四環(huán)素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重組質(zhì)粒中含氨芐青霉素抗性基因（AmpR），因此攜帶目的基因的受體菌在含Amp（氨芐青霉素）的培養(yǎng)基中能形成菌落，在含Tet的培養(yǎng)基中不能形成菌落，D錯(cuò)誤。故選D。4.（2023·浙江·統(tǒng)考高考真題）某研究小組利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將綠色熒光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如圖甲所示。實(shí)驗(yàn)得到能正常表達(dá)兩種蛋白質(zhì)的雜合子雌雄小鼠各1只，交配以期獲得Gata3-GFP基因純合子小鼠。為了鑒定交配獲得的4只新生小鼠的基因型，設(shè)計(jì)了引物1和引物2用于PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖乙所示。

下列敘述正確的是（）A．Gata3基因的啟動(dòng)子無(wú)法控制GFP基因的表達(dá)B．翻譯時(shí)先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白C．2號(hào)條帶的小鼠是野生型，4號(hào)條帶的小鼠是Gata3-GFP基因純合子D．若用引物1和引物3進(jìn)行PCR，能更好地區(qū)分雜合子和純合子【答案】B【解析】A、分析圖中可知，啟動(dòng)子在左側(cè)，GFP基因整合Gata3基因的右側(cè)，啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄后，可以使GEP基因轉(zhuǎn)錄，Gata3基因的啟動(dòng)子能控制GFP基因的表達(dá)，A錯(cuò)誤；B、因啟動(dòng)子在左側(cè)，轉(zhuǎn)錄的方向向右，合成的mRNA從左向右為5′→3′，剛好是翻譯的方向，所以翻譯時(shí)先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正確；C、整合GFP基因后，核酸片段變長(zhǎng)，2號(hào)個(gè)體只有大片段，所以是Gata3-GFP基因純合子，4號(hào)個(gè)體只有小片段，是野生型，C錯(cuò)誤；D、用引物1和引物3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出的片段大小差異較小，無(wú)法較好的區(qū)分片段，D錯(cuò)誤。故選B。5.（2023·湖南·統(tǒng)考高考真題）基因檢測(cè)是診斷和預(yù)防遺傳病的有效手段。研究人員采集到一遺傳病家系樣本，測(cè)序后發(fā)現(xiàn)此家系甲和乙兩個(gè)基因存在突變：甲突變可致先天性耳聾；乙基因位于常染色體上，編碼產(chǎn)物可將葉酸轉(zhuǎn)化為N5-甲基四氫葉酸，乙突變與胎兒神經(jīng)管缺陷（NTDs）相關(guān)；甲和乙位于非同源染色體上。家系患病情況及基因檢測(cè)結(jié)果如圖所示。不考慮染色體互換，回答下列問(wèn)題：

(1)此家系先天性耳聾的遺傳方式是。1-1和1-2生育育一個(gè)甲和乙突變基因雙純合體女兒的概率是。(2)此家系中甲基因突變?nèi)缦聢D所示：正?；騿捂溒?'-ATTCCAGATC……（293個(gè)堿基）……CCATGCCCAG-3'突變基因單鏈片段5'-ATTCCATATC……（293個(gè)堿基）……CCATGCCCAG-3'研究人員擬用PCR擴(kuò)增目的基因片段，再用某限制酶（識(shí)別序列及切割位點(diǎn)為

）酶切檢測(cè)甲基因突變情況，設(shè)計(jì)了一條引物為5′-GGCATG-3'，另一條引物為（寫(xiě)出6個(gè)堿基即可）。用上述引物擴(kuò)增出家系成員Ⅱ-1的目的基因片段后，其酶切產(chǎn)物長(zhǎng)度應(yīng)為bp（注：該酶切位點(diǎn)在目的基因片段中唯一）。-1-1。經(jīng)基因檢測(cè)胎兒（Ⅲ-2）的乙基因型為-/-，據(jù)此推薦該孕婦（Ⅱ-1）葉酸補(bǔ)充劑量為-1?！敬鸢浮?1)常染色體隱性遺傳病1/32(2)5'-ATTCCA-3'8和302(3)4【解析】（1）由遺傳系譜圖可知，由于I-1與I-2均表現(xiàn)正常，他們關(guān)于甲病的基因型均為+/-，而他們的女兒Ⅱ-4患病，因此可判斷甲基因突變導(dǎo)致的先天性耳聾是常染色體隱性遺傳病，由I-1、I-2和Ⅱ-3關(guān)于乙病的基因可以推出乙基因突變導(dǎo)致的遺傳病也是常染色體隱性遺傳病，所以I-1和I-2生出一個(gè)甲和乙突變基因雙純合體女兒的概率為1/4×1/4×1/2=1/32。（2）本題研究甲基因突變情況，二代1為雜合子，兼有正常甲基因和突變甲基因。目的基因?yàn)榧谆?，擴(kuò)增引物應(yīng)與兩基因共有的TAAGGT片段結(jié)合，應(yīng)為ATTCCA?？蓴U(kuò)增出大量正常甲基因和突變甲基因供后續(xù)鑒定。此時(shí)酶切，正常甲基因酶切后片段為8和2+293+7=302bp,突變甲基因無(wú)法被酶切，故不寫(xiě)。后續(xù)可通過(guò)電泳等手段區(qū)分開(kāi)，達(dá)到檢測(cè)甲基因突變情況的目的。（3）Ⅲ-2關(guān)于乙的基因型為-/-，有患NTDs的可能，因此推薦該孕婦（Ⅱ-1）葉酸補(bǔ)充劑量為4mg·d-1。6.（2023·山東·高考真題）科研人員構(gòu)建了可表達(dá)J-V5融合蛋白的重組質(zhì)粒并進(jìn)行了檢測(cè)，該質(zhì)粒的部分結(jié)構(gòu)如圖甲所示，其中V5編碼序列表達(dá)標(biāo)簽短肽V5。

(1)與圖甲中啟動(dòng)子結(jié)合的酶是。除圖甲中標(biāo)出的結(jié)構(gòu)外，作為載體，質(zhì)粒還需具備的結(jié)構(gòu)有（答出2個(gè)結(jié)構(gòu)即可）。(2)構(gòu)建重組質(zhì)粒后，為了確定J基因連接到質(zhì)粒中且插入方向正確，需進(jìn)行PCR檢測(cè)，若僅用一對(duì)引物，應(yīng)選擇圖甲中的引物。已知J基因轉(zhuǎn)錄的模板鏈位于b鏈，由此可知引物F1與圖甲中J基因的（填“a鏈”或“b鏈”）相應(yīng)部分的序列相同。(3)重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞內(nèi)正確表達(dá)后，用抗J蛋白抗體和抗V5抗體分別檢測(cè)相應(yīng)蛋白是否表達(dá)以及表達(dá)水平，結(jié)果如圖乙所示。其中，出現(xiàn)條帶1證明細(xì)胞內(nèi)表達(dá)了，條帶2所檢出的蛋白（填“是”或“不是”）由重組質(zhì)粒上的J基因表達(dá)的。【答案】(1)RNA聚合酶限制酶切割位點(diǎn)、標(biāo)記基因、復(fù)制原點(diǎn)等(2)F2和R1或F1與R2a鏈(3)J-V5融合蛋白不是【解析】（1）基因表達(dá)載體的構(gòu)建啟動(dòng)子是為了啟動(dòng)下游基因的“表達(dá)”，表達(dá)首先需要轉(zhuǎn)錄，因此RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位才是轉(zhuǎn)錄的起始。作為運(yùn)載體必須具備的條件：①要具有限制酶的切割位點(diǎn)；②要有標(biāo)記基因（如抗性基因），以便于重組后重組子的篩選；③能在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定存在并復(fù)制；④是安全的，對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害，而且要易從供體細(xì)胞分離出來(lái)，圖中甲有啟動(dòng)子和終止子等，因此質(zhì)粒還需具備的結(jié)構(gòu)有限制酶的切割位點(diǎn)、標(biāo)記基因、復(fù)制原點(diǎn)等。（2）據(jù)圖甲可知，引物F2與R1或F1與R2結(jié)合部位包含J基因的堿基序列，因此推測(cè)為了確定J基因連接到質(zhì)粒中且插入方向正確，進(jìn)行PCR檢測(cè)時(shí)，若僅用一對(duì)引物，應(yīng)選擇圖甲中的引物F2和R1或F1與R2。b是模板鏈，而根據(jù)圖上啟動(dòng)子和終止子的位置可知轉(zhuǎn)錄方向是圖上從左向右，對(duì)應(yīng)的模板鏈方向應(yīng)該是3’-5'，非模板鏈（也就是a鏈）是5'-3'；考慮到DNA復(fù)制的方向是子鏈的5’-3'，引物基礎(chǔ)上延伸的方向肯定是5'-3'，所以引物結(jié)合的單鏈其方向是3'-5'；圖中F1是前引物，在左側(cè)，所以其配對(duì)的單鏈?zhǔn)?’-5'的b鏈，故其序列應(yīng)該與a鏈相應(yīng)部分的序列相同。（3）據(jù)圖乙可知，用抗J蛋白抗體和抗V5抗體分別檢測(cè)，均出現(xiàn)條帶1，說(shuō)明條帶1是J-V5融合蛋白?？笿蛋白抗體檢測(cè)出現(xiàn)條帶2，抗V5抗體檢測(cè)不出現(xiàn)條帶2，說(shuō)明條帶2所檢出的蛋白不是由重組質(zhì)粒上的J基因表達(dá)的。7.（2022·山東·高考真題）某種類型的白血病由蛋白P引發(fā)，蛋白UBC可使P被蛋白酶識(shí)別并降解，藥物A可通過(guò)影響這一過(guò)程對(duì)該病起到治療作用。為探索藥物A治療該病的機(jī)理，需構(gòu)建重組載體以獲得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特