骨性關節(jié)炎兔骨內(nèi)固定治療過程中關節(jié)軟骨的動態(tài)改變

骨性關節(jié)炎兔骨內(nèi)固定治療過程中關節(jié)軟骨的動態(tài)改變

骨關節(jié)炎（oa）是一種常見的關節(jié)疾病，嚴重危害老年人的健康。隨著年齡的增長，發(fā)病率呈顯著上升，但其發(fā)病機制尚不清楚。建立骨關節(jié)動物模型對病因、病理和治療的研究是非常重要的。目前,已有許多關于骨性關節(jié)炎動物實驗模型的研究,但大部分僅針對骨關節(jié)炎形成后骨關節(jié)某一方面的改變進行探討,如光鏡下軟骨組織形態(tài)學改變、關節(jié)液中細胞因子如白細胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)和/或腫瘤壞死因子α(Tumornecrosisfactorα,TNF-α)含量變化等。很少有研究涉及關節(jié)軟骨組織形態(tài)學和細胞因子(IL-1β和TNF-α)的連續(xù)動態(tài)變化,有關采用電鏡對骨關節(jié)炎發(fā)生過程中軟骨形態(tài)變化的研究更少。本研究通過切斷兔膝關節(jié)內(nèi)側(cè)副韌帶和內(nèi)側(cè)半月板制備骨性關節(jié)炎動物模型,分別采用光鏡和掃描電鏡連續(xù)動態(tài)觀察其關節(jié)軟骨組織學變化,并在骨性關節(jié)炎發(fā)生過程中的不同時間點檢測關節(jié)液中IL-1β和TNF-α含量的變化,旨在對骨關節(jié)炎模型的發(fā)生發(fā)展作一相對全面的研究,深入探討骨性關節(jié)炎發(fā)生發(fā)展的過程和發(fā)病機制。1材料和方法1.1試驗組和手術方法15只成年新西蘭大白兔(30個膝關節(jié)),體重為2.5kg~3kg,由北京大學醫(yī)學部動物部提供。動物隨機分為實驗組(12只,24個膝關節(jié))和對照組(3只,6個膝關節(jié))兩組。實驗組均在兩側(cè)關節(jié)施行手術。經(jīng)耳緣靜脈注射20%烏拉坦(5ml/kg)全身麻醉,無菌條件下行膝內(nèi)側(cè)髕骨旁切口,仔細解剖內(nèi)側(cè)副韌帶,切斷并切除內(nèi)側(cè)副韌帶長約0.5cm;打開關節(jié)腔,切除內(nèi)側(cè)半月板,縫合關節(jié)腔及皮膚。術后每只兔肌注40萬單位青霉素,連續(xù)3天,以防膝關節(jié)感染。3只正常兔作為對照組。1.2對照組治療方法實驗組動物分別于術后1周、2周、3周、4周取材,實驗組每次取材3只(6個膝關節(jié)),對照組在第4周取材3只(6個膝關節(jié))。麻醉后從髕上囊部位注射入關節(jié)腔1ml無菌PBS,反復活動關節(jié)后,仔細抽取灌洗液,做好標記后立即置于-70℃冰箱中保存?zhèn)溆?然后采用空氣栓塞處死動物,切開關節(jié)腔,將游離的關節(jié)和關節(jié)囊固定于中性多聚甲醛固定液中。1.3觀察指標1.3.1軟骨表面的石墨分類標本于10%多聚甲醛中固定3天后,流水沖洗12小時。內(nèi)外股骨髁軟骨面用蒸餾水洗凈后,用濾紙輕輕擦干,用毛筆將墨汁刷于軟骨表面,半分鐘后,用蒸餾水將墨汁沖去,將上述過程再重復一遍。根據(jù)Yoshioka等的分類標準將軟骨表面的大體所見分為4級:Ⅰ級:軟骨面完整,無墨汁沉積;Ⅱ級:軟骨表面輕度纖維化,墨汁染色可見長條形的斑點樣沉積或淡灰色斑痕;Ⅲ級:軟骨表面明顯纖維化,墨汁染色可見深黑色斑痕,呈天鵝絨狀;Ⅳ級:軟骨表面糜爛,墨汁染色見軟骨缺失,暴露軟骨下骨。1.3.2木本糖組hematoxyin&在精神質(zhì)量和甲苯胺藍染色關節(jié)軟骨經(jīng)過固定后,常規(guī)脫鈣、沖洗、脫水、透明、浸蠟、包埋和切片,蘇木素-伊紅(HematoxylinandEosin,HE)和甲苯胺藍染色。1.3.3掃描電鏡觀察標本取材后,經(jīng)戊二醛固定,蔗糖沖洗及鋨酸處理后,進行臨界點干燥,噴金鍍膜,完成電鏡標本制作,在掃描電鏡(日本電子公司,型號JSM-5600LV)下觀察標本。1.3.4elisa試驗采用酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)方法。分別取每份關節(jié)腔灌洗液100μl進行IL-1β和TNF-α蛋白表達分析。應用美國Biosource公司提供的ELISA試劑盒,根據(jù)說明書具體操作。1.4染色結(jié)果的統(tǒng)計學處理所有數(shù)據(jù)均用SPSS11.5進行統(tǒng)計分析。關節(jié)軟骨墨汁染色結(jié)果用Kruskal-Wallis秩和檢驗,ELISA結(jié)果用t檢驗,P<0.05為有統(tǒng)計學意義。2結(jié)果2.1各級別單位的檢測結(jié)果表1顯示,對照組股骨內(nèi)髁Ⅰ級5例,Ⅱ級1例。實驗組1周股骨內(nèi)髁Ⅱ級4例,Ⅲ級2例;2周Ⅱ級1例,Ⅲ級4例,Ⅳ級1例;3周Ⅲ級4例,Ⅳ級2例;4周Ⅲ級3例,Ⅳ級3例。采用Kruskal-Wallis秩和方法檢驗各實驗組與對照組之間均有顯著性差異(P<0.05)。2.2軟骨組織結(jié)構失穩(wěn)對照組:HE染色示正常軟骨基質(zhì)呈淡粉色,著色均勻,軟骨細胞核呈藍色。軟骨細胞排列有序,從上至下依次為表層、中間層、柱狀層和軟骨下骨層(圖1A);甲苯胺藍染色均勻,無基質(zhì)失染(圖1B);掃描電鏡示軟骨表面呈壟溝樣排列,排列有序,軟骨表面無血管及細胞分布,膠原纖維不裸露(圖1C)。實驗組1周:HE染色示細胞排列開始出現(xiàn)紊亂,軟骨內(nèi)細胞密度不均一,有細胞簇聚現(xiàn)象(圖1D);甲苯胺藍染色部分失染(圖1E);掃描電鏡示關節(jié)軟骨表面壟溝樣結(jié)構可見,壟部低平,溝部變淺,無軟骨細胞及膠原纖維裸露(圖1F)。實驗組2周:HE染色示軟骨表層不平整,細胞排列進一步紊亂,細胞簇聚(圖1G);甲苯胺藍染色軟骨層失染(圖1H);掃描電鏡示關節(jié)軟骨表面壟溝樣結(jié)構消失,軟骨表面出現(xiàn)小裂(圖1I)。實驗組3周:HE染色示軟骨表層缺失,軟骨層變薄,表面纖維化(圖1J);甲苯胺藍染色軟骨層失染(圖1K);掃描電鏡示軟骨表面膠原纖維裸露、斷裂(圖1L)。實驗組4周:HE染色示軟骨表層缺失嚴重,軟骨層進一步變薄,軟骨細胞大量減少,細胞大量簇聚(圖1M);甲苯胺藍染色軟骨全層失染(圖1N);掃描電鏡示軟骨細胞裸露,表面出現(xiàn)空的陷窩(圖1O)。2.3il-1在術后2周和4周時療效造模手術后,關節(jié)液中炎性因子IL-1β和TNF-α表達明顯升高。IL-1β在術后2周時達峰值,此后逐漸下降,到4周仍處于較高水平。TNF-α在1周時明顯升高,2周時有所下降,3周時又升高,4周時下降,但仍處于較高水平(表2)。3小鼠骨髓結(jié)構變化骨性關節(jié)炎又稱退行性骨關節(jié)病,是一種累及關節(jié)軟骨、軟骨下骨、關節(jié)滑膜等多種組織的疾病,而關節(jié)軟骨的退行性改變是該病中主要病變的部位,通過建立骨關節(jié)炎的動物模型進行實驗研究是對其發(fā)病機理、預防及治療研究的必要手段。近年來制備OA動物模型的方法有以下幾種。Okazaki等用石膏將兔的膝關節(jié)固定于伸直位5~6周可獲得OA模型。但有人發(fā)現(xiàn)此方法動物痛苦大,模型程序較難標準控制,獲得的OA模型效果不甚滿意。Marijnissen等在犬的膝關節(jié)股骨髁負重區(qū)關節(jié)軟骨處銳器劃痕,但不傷及軟骨下骨,10周后發(fā)現(xiàn)損傷軟骨周圍有軟骨細胞聚集,蛋白多糖中度丟失,軟骨細胞間質(zhì)丟失,軟骨表面膠原纖維變性,深層軟骨細胞成簇排列,常伴有異染色質(zhì)減少等病理性改變,所有這些改變都與OA特征相符合。但這一模型難以標準化,未得到廣泛認可。Kikuchi等將膠原酶注入兔膝關節(jié)腔內(nèi),發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)了典型的關節(jié)軟骨退行性變,并隨時間的推移而逐漸加重,且與劑量呈正相關。本實驗采用切斷并切除內(nèi)側(cè)副韌帶0.5cm合并切除內(nèi)側(cè)半月板成功建立了OA兔的模型,研究發(fā)現(xiàn)該制模方法手術創(chuàng)傷小,軟骨病變部位重復性好,建模時間短,模型穩(wěn)定,能較好地反映OA軟骨退變的全過程,便于對OA軟骨作系統(tǒng)研究。關節(jié)軟骨的退行性改變及破壞是OA的基本病變。最早期的病理變化發(fā)生于關節(jié)軟骨表面的膠原纖維退化,使軟骨超負荷面變薄,可見龜裂、粗糙不平,隨著膠原纖維化的進一步發(fā)展,膠原退化在關節(jié)損害的邊緣和臨近的細胞間質(zhì)更加明顯。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)實驗組1周:HE染色可見細胞排列開始出現(xiàn)紊亂,軟骨內(nèi)細胞密度不均一,有細胞簇聚現(xiàn)象;甲苯胺藍染色部分失染;掃描電鏡可見關節(jié)軟骨表面壟溝樣結(jié)構,壟部低平,溝部變淺,無軟骨細胞及膠原纖維裸露。這可能是由于蛋白多糖丟失造成的,而此時的膠原纖維網(wǎng)架結(jié)構尚未被破壞。實驗組2周:HE染色示軟骨表層不平整,細胞排列進一步紊亂,細胞簇聚;甲苯胺藍染色軟骨層失染;掃描電鏡示關節(jié)軟骨表面壟溝樣結(jié)構消失,軟骨表面出現(xiàn)小裂。這表明軟骨細胞可能開始失代償,失代償?shù)能浌羌毎痛鷥斳浌羌毎餐嬖?。軟骨細胞代謝及反應性增殖,形成細胞簇聚現(xiàn)象,都可能是軟骨代償?shù)谋憩F(xiàn)。電鏡顯示表面出現(xiàn)小裂可能是失代償?shù)谋憩F(xiàn)。隨著OA的進一步發(fā)展,軟骨的深層發(fā)生裂隙,關節(jié)軟骨失去其原來的藍白色和光滑的色澤而變成暗黃和顆粒狀。軟骨面的缺損程度在病變不同時期各異。磨損最大的關節(jié)面上的軟骨被擦去,使軟骨下骨顯露。由于不斷摩擦,骨面變得很光滑,呈象牙樣骨,磨損較小的外圍軟骨面出現(xiàn)增殖和肥厚。由于中央部位軟骨的消失和外圍軟骨的增生,改變了關節(jié)面上生物應力的分布和幅度,使關節(jié)面不同部位承受不同的應力,至關節(jié)軟骨全層消失,露出骨質(zhì)。實驗組3周:HE染色示軟骨表層缺失,軟骨層變薄,表面纖維化;甲苯胺藍染色軟骨層失染;掃描電鏡顯示軟骨表面膠原纖維裸露、斷裂。隨著骨關節(jié)炎的發(fā)展,軟骨損傷逐漸加重,代償?shù)能浌羌毎饾u減少,失代償?shù)能浌羌毎饾u增多。軟骨細胞變性壞死、膠原纖維斷裂暴露均是失代償?shù)谋憩F(xiàn)。實驗組4周:HE染色示軟骨表層缺失嚴重,軟骨層進一步變薄,軟骨細胞大量減少,細胞大量簇聚;甲苯胺藍染色軟骨全層失染;掃描電鏡軟骨細胞裸露,表面出現(xiàn)空的陷窩。軟骨進一步被破壞,表層已經(jīng)缺失,完整的網(wǎng)架結(jié)構己被破壞,軟骨細胞大量減少,細胞大量簇聚已表明此時的軟骨處于失代償狀態(tài)。近年來的研究表明,細胞因子和生長因子在骨性關節(jié)炎發(fā)生發(fā)展的病理生理過程中起著重要作用,它們與滑膜、關節(jié)軟骨和軟骨下骨的功能改變密切相關。一些因子在關節(jié)炎的病理過程中對關節(jié)軟骨和關節(jié)滑膜具有一定的破壞作用,其中最引人注目的是IL-1β和TNF-α,這兩種細胞因子是關節(jié)炎病理過程中促進軟骨基質(zhì)降解和關節(jié)軟骨破壞的兩種最重要的細胞因子。研究證實在OA患者的關節(jié)液中IL-1、TNF等細胞因子水平明顯升高。IL-1可以誘導NF-kappB家族成員bcl-3基因抑制因子的表達,從而抑制bcl-3表達,促進軟骨細胞凋亡。此外,IL-1可以促進軟骨細胞和和滑模細胞合成基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)和PGE,并且能抑制透明軟骨特異性II、IX膠原和蛋白多糖的合成,和TNF有協(xié)同作用,TNF可促進PGE的產(chǎn)生,并且可誘導軟骨細胞產(chǎn)生過氧化反應,與IL-1共同促進軟骨吸收,從而介導了骨性關節(jié)炎軟骨的破壞。Sandra在鏈球菌細胞壁誘導的關節(jié)炎研究中發(fā)現(xiàn)IL-1β在關節(jié)軟骨的破壞和炎癥細胞的浸潤方面占有主要地位,而TNF-α在關節(jié)腫脹方面發(fā)揮作用;IL-1β和TNF-α在誘導過程中高表達,且TNF-α的高峰早于IL-1β的高峰出現(xiàn);并認為在這種動物模型中IL-1β的表達不依賴于TNF-α的調(diào)節(jié)。本研究結(jié)果顯示IL-1β在1周時已明顯升高,2周時達峰值,3周時開始下降,4周時仍然維持在較高水平。TNF-α變化呈雙峰態(tài)改變,1周和3周時是峰值,4周時仍然維持較高水平,提示這兩種細胞因子可能在骨性關節(jié)炎發(fā)生的不同階段具有不同的作用,而且它們表達的調(diào)控機制也有所不同,與Sandra等學者的研究結(jié)果相似。本實驗亦發(fā)現(xiàn)IL-1β和TNF-α的表達水平未見隨軟骨損傷的進行性加重而不斷升高。關節(jié)液中細胞因子的高表達可能與關節(jié)內(nèi)組織的急性損傷和急性炎癥反應有關,隨著急性炎癥期的結(jié)束,肉芽組織和基質(zhì)蛋白形成,IL-1β和TNF-α的分泌有所下降,但仍然高表達。骨性關節(jié)炎的發(fā)病機制十分復雜,各種細胞因子和氧化劑參與其中,它們相互作用,形成一個復雜的網(wǎng)絡,具體機制仍不十分清楚,有待于進一步的研究。在基因治療的研究中,IL-1β和TN