蔬菜中有機磷農藥的殘留凈化及分離方法研究

蔬菜中有機磷農藥的殘留凈化及分離方法研究

有機磷農藥具有光譜效應和高效化性等優(yōu)點。這是目前的三種農藥之一。經過幾十年的發(fā)展，它在品種、數(shù)量和產量上達到了各種農藥的1:1%。由于有機磷農藥對細菌、害蟲、雜草生長等具有有效的控制作用和提高農業(yè)產量而被廣泛使用,但有機磷農藥使用過多,產生的負面效應也日益突顯,致使農產品中農藥殘留嚴重超標,長期攝取含有機磷農藥及代謝產物的農作物會對人的健康造成較大影響［2］。隨著檢測技術的發(fā)展和各國在食品安全研究方面的突破,除了對原藥殘留進行檢測外,增加了對藥物殘留代謝產物的研究,并對其毒性較強的代謝產物進行檢測。有機磷農藥降解產物往往具有較強毒性,如敵百蟲在一定條件下可迅速轉化成毒性更強的敵敵畏［3］,乙酰甲胺磷在環(huán)境中容易降解成甲胺磷［4］,甲基對硫磷等含有苯硝基類有機磷農藥最主要的降解產物是對硝基酚［5］,馬拉硫磷代謝產物為中間體O,O-二甲基二硫代磷酸酯等［6］。我國在國家標準GB2763-2012中對蔬菜中各種有機磷農藥的殘留限量有明確的規(guī)定,4種有機磷農藥及其代謝產物的殘留限量為0.02~8mg/kg(對硝基酚及O,O-二甲基二硫代磷酸酯沒有規(guī)定),美國及歐盟的殘留限量標準與GB2763-2012所規(guī)定的限量基本一致［7］。有機磷農藥的檢測方法主要有氣相色譜法［8］、氣相色譜-質譜聯(lián)用法［9］、氣相色譜-串聯(lián)質譜法［10］、液相色譜-串聯(lián)質譜法［11］及毛細管電泳法［12］等,前處理方法主要為液液萃取［8，11］、QuEChERS技術［10，13］、固相萃?。?，14］、固相微萃取［15］等,但方法都局限于農藥母體的檢測,很少關注農藥代謝產物的同時檢測,而部分有機磷農藥代謝產物在食品中的殘留富集,對人體帶來的傷害甚至遠高于有機磷農藥本身［4］。有機磷農藥代謝物的檢測,若局限于某一種化合物或者是幾種可能代謝物的檢測,不具有針對性,不能作為有機磷農藥的標記物［16，17］。農藥及其代謝產物的檢測,對食品安全具有更重要的價值,可能是未來農藥殘留檢測的熱點和難點。本文以菠菜和洋蔥為研究對象,用固相萃取-液相色譜-質譜聯(lián)用技術同時檢測4種有機磷農藥及其代謝產物,對農藥殘留檢測的技術儲備及農藥代謝產物的研究具有重要意義。1實驗部分1.1試劑與標準品WatersACQUITYUltraPerformance液相色譜系統(tǒng),并配有溶劑管理器;WatersXEVOTQ三重四極桿質譜儀(Waters公司);均質機(T25,IKA公司);組織搗碎機(Philips公司);固相萃取裝置(Supelco公司)等。有機磷農藥及其代謝產物標準品:馬拉硫磷(malathion,純度99.5%,Fluka公司),O,O-二甲基二硫代磷酸酯(dimethyldithiophosphate,純度97%,維賽諾化學技術有限公司),甲基對硫磷(parathion-methyl,純度99.8%,Sigma公司),對硝基酚(4-ni-trophenol,純度99.5%,國藥集團化學試劑有限公司),敵百蟲(trichlorfon,純度99.5%,Sigma公司),敵敵畏(dimethyldichlorovinyphosphate,DDVP,純度99.8%,Fluka公司),乙酰甲胺磷(acephate,純度99.5%,Fluka公司),甲胺磷(methamidophos,純度99.5%,Fluka公司)。標準品用乙腈溶解,于4℃冰箱中保存,使用時用流動相定容。500mg6mL活性炭固相萃取柱及500mg6mL弗羅里硅土固相萃取小柱均購自Supelco公司,其他試劑均為分析純試劑。1.2樣品的制備葉菜以菠菜為試驗樣本。提取:樣品用組織搗碎機處理后,稱取約5g(精確到0.01g)于50mL離心管中,加入2gMgSO4、20mL乙酸乙酯,均質器均質2min(不低于10000r/min),然后于4000r/min下離心5min,取上層清液。凈化:取10mL上層清液過500mg6mL活性炭和500mg6mL弗羅里硅土串聯(lián)小柱(小柱經5mL乙酸乙酯活化處理),再用10mL乙酸乙酯洗脫小柱,合并流出液和上樣液,氮吹至近干,用1.0mL乙腈-5mmol/L乙酸銨水溶液(1∶1,v/v)溶解殘渣,待測定。其他色素含量較低的蔬菜以洋蔥為試驗樣本。提取方法與葉菜相同,凈化方法略有不同,10mL上層清液只經過弗羅里硅土小柱,其他操作完全相同。1.3流動相和梯度洗脫程序色譜柱:ACQUITYUPLCBEHHILIC(50mm×2.1mm,1.7μm);柱溫:30℃。進樣器用強溶劑(30%乙腈水溶液)和弱溶劑(70%乙腈水溶液)清洗。流動相:溶劑A為乙腈,溶劑B為5mmol/L的乙酸銨水溶液。梯度洗脫程序:0~1.0min,50%B;1.0~1.5min,50%B~70%B;1.5~2.0min,70%B;2.0~2.1min,70%B~50%B;2.1~3.0min,50%B。流速:0.25mL/min。1.4劑氣、霧無砂系統(tǒng)毛細管電壓:2.5kV;離子源溫度:150℃;脫溶劑氣(N2)流速:650L/h;霧簾氣(N2)流速:50L/h;脫溶劑氣溫度:400℃;碰撞氣:氬氣。數(shù)據(jù)處理為MassLynxv4.1系統(tǒng)。其他質譜參數(shù)見表1。2結果與討論2.1反相凈化方式的確定有機磷農藥及其代謝產物在乙酸乙酯、乙腈、丙酮及二氯甲烷等試劑中均有較好的溶解度,考慮到二氯甲烷對環(huán)境的污染及乳化問題,丙酮更適合于糧谷等物質中的有機磷及代謝物提取,蔬菜通常采用乙腈和乙酸乙酯作提取試劑。葉菜類蔬菜由于多數(shù)色素含量較高,而乙腈對葉綠素、葉黃素及胡蘿卜素的提取效率高,提取液顏色較深,凈化效果不好;采用乙酸乙酯進行提取,色素含量較低,再用活性炭小柱除去殘留的色素,效果較為理想。試驗中選擇反相C18凈化小柱,將提取液濃縮后用含5%甲醇的乙酸銨溶液溶解過柱,由于O,O-二甲基二硫代磷酸酯及對硝基酚極性較強,柱保留效果不好,損失較大;采用正相凈化方式,用乙酸乙酯溶解,過氧化鋁小柱,對硝基酚的吸附作用較大,造成回收率不高;使用乙酸乙酯溶解,過弗羅里硅土小柱,凈化效果最佳,因而采用弗羅里硅土的正相取凈化方式。2.2o,o-二甲基二硫代磷酸酯和pfb-br衍生高效液相色譜法檢測傳統(tǒng)有機磷農藥的檢測一般采用氣相色譜或氣相色譜-質譜聯(lián)用的方法［8，9］,但在檢測O,O-二甲基二硫代磷酸酯及敵百蟲的過程中都遇到了一些問題［16］。O,O-二甲基二硫代磷酸酯和敵百蟲都是一種遇熱易分解的物質,實驗發(fā)現(xiàn),O,O-二甲基二硫代磷酸酯遇熱甲基化或分解成其他小分子化合物(見圖1),但轉化效率不高,速率較慢,因而色譜峰對稱性不好,峰形不尖銳,定量誤差較大。O,O-二甲基二硫代磷酸酯的檢測多采用五氟溴芐苯(PFB-Br)衍生,將羥基屏蔽以減小O,O-二甲基二硫代磷酸酯的活性,再進行氣化檢測的方式,但是衍生效率不高,且步驟較為繁瑣,也不利于多組分的同時檢測［16］。敵百蟲由于在高溫條件下C-P鍵易發(fā)生斷裂,分子重排后生成三氯乙醛和亞磷酸二甲酯,一般采用對亞磷酸二甲酯的檢測來確定敵百蟲的含量,但是敵百蟲的定量分解與溫度條件關系密切,只有在氣相色譜進樣口超過260℃時,定量分解才較為充分［18］。所以O,O-二甲基二硫代磷酸酯和敵百蟲的檢測條件有一定的矛盾性,采用氣相色譜或氣相色譜-質譜聯(lián)用直接或衍生的檢測方法,都不利于多組分的同時檢測。采用液相色譜-質譜聯(lián)用的方式進行檢測,多數(shù)化合物效果較好,靈敏度高,且不需要衍生,但是O,O-二甲基二硫代磷酸酯和對硝基酚極性較強,保留弱,使用C18色譜柱不能滿足分離要求。試驗對色譜條件進行了優(yōu)化和選擇,使用ACQUITYUPLCBEHHILIC色譜柱進行分離,效果較好(見圖2)。以菠菜作為基質,對4種有機磷農藥及其代謝物采用活性炭和弗羅里硅土串聯(lián)固相萃取小柱凈化后的絕對基質效應進行了考察,其基質效應都不高于45.1%(見表2),說明凈化效果及質譜條件較為合理,有利于定量分析的準確性。2.3加標回收率測定在蔬菜(菠菜)中添加有機磷農藥及其代謝產物標準品進行回收率測定,每個水平測定6次,其加標回收率為76.9%~102.8%,RSD為5.92%~10.19%(見表2),結果表明方法符合檢測要求。2.4濃度計的確定將8種標準品配制成系列濃度的標準溶液,定量限采用在樣品處理后的基質中添加標準品的方式獲得,以至少大于10倍信噪比時的測得濃度計;以峰面積為縱坐標、標準品的質量濃度為橫坐標繪制標準曲線,計算相關系數(shù),結果表明,在0.01~1.00mg/kg范圍內均線性關系良好,相關系數(shù)(見表3)均滿足檢測要求。2.5質譜檢測結果試驗采用購自哈爾濱市農貿市場的白菜、辣椒及西紅柿,每個品種均有兩個樣本,用建立的固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質譜檢測方法進行檢測,發(fā)現(xiàn)一個西紅柿樣本中檢測到2.3μg/kg的馬拉硫磷;一個辣椒樣本中檢測到1.2μg/kg的對硝基酚,但由于對硝基酚也可能為環(huán)境污染物,不能說明對硝基酚一定來自甲基對硫磷的降解。其他樣本均未檢出目標農藥及其代謝物。3色譜柱和色譜柱的選擇色素含量高的蔬菜前處理采用