一種多靶標(biāo)免疫磁敏傳感器的研制

一種多靶標(biāo)免疫磁敏傳感器的研制

1生物傳感器技術(shù)的應(yīng)用近年來，微流技術(shù)在化學(xué)、醫(yī)學(xué)、科學(xué)和技術(shù)部等領(lǐng)域得到了迅速發(fā)展。微流體芯片,又稱為“芯片實(shí)驗(yàn)室”(Lab-on-a-chip),利用微機(jī)電技術(shù)將一般實(shí)驗(yàn)室所使用的分離、反應(yīng)、混合等裝置微小化到芯片上,以進(jìn)行生化反應(yīng)、分析,可以對微量流體進(jìn)行復(fù)雜、精確的操作,因其具有體積輕巧、使用樣品和試劑量少、反應(yīng)速度快、平行處理大量樣品等優(yōu)點(diǎn),在生物分析技術(shù)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。生物傳感器技術(shù)作為生物分析技術(shù)中的一個(gè)重要分支,結(jié)合了生命科學(xué)、分析化學(xué)、物理學(xué)、計(jì)算機(jī)信息科學(xué)等相關(guān)技術(shù),能夠?qū)Υ龣z物質(zhì)進(jìn)行快速分析,在醫(yī)療檢測、環(huán)境監(jiān)測、食品安全、軍事安全等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。其中,磁隧道結(jié)(Magnetictunneljunction,MTJ)傳感器[10,11,12,13,14,15,16]是一種利用巨磁阻效應(yīng)的新型生物傳感器,以超順磁顆粒為檢測探針,具有體積小、成本低、生物背景低、靈敏度高、高通量等特點(diǎn),有望為生物學(xué)、藥學(xué)研究、醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)等領(lǐng)域提供便攜、快捷的新技術(shù)平臺。腫瘤標(biāo)志物是指在腫瘤的發(fā)生和增殖過程中,由腫瘤細(xì)胞本身所產(chǎn)生或由機(jī)體對腫瘤細(xì)胞反應(yīng)而產(chǎn)生的,反映腫瘤存在種生長的一類物質(zhì)。多種腫瘤標(biāo)志物的聯(lián)合檢測能夠提高診斷的準(zhǔn)確性,上廣泛應(yīng)用于不同類型腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)和診療。目前的腫瘤標(biāo)志物檢測方法主要有酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)、放射免疫分析法、熒光免疫分析法和膠體金試紙條檢測等,這些方法多是針對單個(gè)標(biāo)志物的單靶標(biāo)測試,且耗時(shí)長,操作較復(fù)雜。結(jié)合微流體技術(shù)檢測體系,可以提高自動化程度;磁敏傳感器檢測技術(shù),可以進(jìn)行高靈敏度、高通量、多靶標(biāo)的快速測試,可以為腫瘤標(biāo)志物的聯(lián)合檢測提供高效的檢測方法。本研究以磁敏傳感器為平臺,設(shè)計(jì)并建立研制了一種芯片上的微流體磁敏生物傳感器,評價(jià)了基于磁敏傳感器的消化系統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物多靶標(biāo)定量檢測的可行性。2實(shí)驗(yàn)部分2.1b型超純水系統(tǒng)磁敏傳感器檢測儀樣機(jī)及配套磁敏傳感器測試卡(40mm×50mm)由東莞博識生物科技有限公司與中國科學(xué)院理化技術(shù)研究所聯(lián)合研制;MTJ傳感器陣列(6.6mm×10.7mm×0.75mm,MagicTechnologies,US);DZF-6020型真空干燥箱;L0107-1A注射泵(保定蘭格恒流泵有限公司);BX51熒光顯微鏡(Olympus公司);EASYpureLF超純水系統(tǒng)(美國Barnstead公司)。甲胎蛋白(AFP)抗原標(biāo)準(zhǔn)品、癌胚抗原(CEA)標(biāo)準(zhǔn)品、糖鏈抗原(CA19-9)標(biāo)準(zhǔn)品、抗AFP包被抗體、抗CEA包被抗體、抗CA19-9包被抗體、Biotin標(biāo)記抗AFP抗體、Biotin標(biāo)記抗CEA抗體、Biotin標(biāo)記抗CA19-9抗體(美國FitzgeraldIndustriesInternational公司);牛血清白蛋白(BSA,北京欣經(jīng)科生物技術(shù)公司);優(yōu)級純胎牛血清(北京欣經(jīng)科生物技術(shù)公司);親和素-超順磁顆粒(Avidin-beads,法國Ademtech公司);3-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷(GPTS,97%,美國AlfaAesar公司);Na2HPO4,KH2PO4,Na2CO3和NaHCO3(美國Merck公司);實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。2.2mtj傳感器原理磁敏傳感器是以超順磁顆粒作為探針,通過MTJ傳感器陣列芯片對生物分子捕捉到的超順磁顆粒的響應(yīng),實(shí)現(xiàn)對芯片表面的生物分子進(jìn)行分析檢測。在外加磁場作用下,超順磁顆粒被磁化、產(chǎn)生磁場(圖1),磁顆粒產(chǎn)生的磁場干擾下方的MTJ傳感器,使其產(chǎn)生電阻率變化、進(jìn)面轉(zhuǎn)化為電流信號變化,即得到磁顆粒數(shù)目的信號。腫瘤標(biāo)志物的檢測是使用夾心免疫反應(yīng)原理,芯片表面的第一抗體(1stAntibody)、血樣中的抗原(Antigen)與生物素修飾的第二抗體(2ndAntibody-Biotin)通過特異的免疫反應(yīng),形成夾心結(jié)構(gòu);超順磁顆粒(Avidin-Bead)上的親和素與第二抗體的生物素結(jié)合,從而被捕獲到芯片表面;當(dāng)施加微弱磁場時(shí),MTJ傳感器感應(yīng)到磁顆粒,產(chǎn)生電流信號,信號大小可以反映出樣品中的抗原濃度,以達(dá)到定量檢測樣品中靶標(biāo)分子的目的。2.3微流體通道測試模塊將修飾了特定抗體的磁敏傳感器集成到微流體測試卡內(nèi),實(shí)現(xiàn)程序化進(jìn)樣、反應(yīng)、分離和測試。如圖2A所示,整個(gè)測試卡是由樣品舟(Cartridge)、微通道層(PDMSlayer)和芯片印制電路板(PrintedcircuitboardwithMTJchip,PCBwithMTJchip)三層結(jié)構(gòu)構(gòu)成。樣品舟上共有4個(gè)液體注入口,分別為待檢測樣品(Sample)、清洗液(Rinsingbuffer)、生物素修飾的第二抗體(2ndAntibody-biotin)和親和素-磁顆粒(Avidin-beads)。在PDMS層上設(shè)計(jì)有液體流動的微通道,進(jìn)樣口內(nèi)的液體在微量注射泵的驅(qū)動下,依次從不同的進(jìn)樣口流經(jīng)芯片的點(diǎn)樣區(qū)進(jìn)入廢液池,圖2B展示的是測試卡中微流體通道的平面圖。在芯片上不同區(qū)域包被不同抗體,可以達(dá)到多靶標(biāo)同時(shí)測試的目的。2.4實(shí)驗(yàn)步驟2.4.1標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制磷酸鹽緩沖溶液(PBS,pH7.4):以KH2PO4和Na2HPO4配制,并用H3PO4和NaOH溶液調(diào)節(jié)至pH7.4。包被緩沖液為0.05mol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.6)。0.1%BSA-PBST溶液為清洗液、Antibody-Biotin及Avidin-Beads的稀釋液,1%BSA-PBST作為封閉液。標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:取適量抗原標(biāo)準(zhǔn)品,用胎牛血清稀釋至特定濃度使用。以上所有溶液均加入0.04%NaN3,于4℃保存。2.4.2抗氧化活性的測定全部反應(yīng)過程在室溫下進(jìn)行。在3-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷處理的芯片表面,用pH9.6的碳酸鹽緩沖液制備的濃度為20mg/L的AFP,CEA,CA19-9抗體包被溶液及BSA溶液,分別取500nL滴加在芯片測試區(qū)域,在濕度為90%的環(huán)境中溫育10min;加入1%BSA-PBST封閉液,5min后將芯片裝入測試卡,向測試卡中注入40μL待測樣品,室溫下樣品中抗原與固定抗體反應(yīng)一定時(shí)間后,用清洗液沖洗,除去游離的抗原;再注入40μL混合標(biāo)記抗體-生物素,室溫下反應(yīng)一定時(shí)間后,注入80μL清洗液;然后注入40μL親和素-磁顆粒,反應(yīng)一定時(shí)間;最后注入80μL清洗液沖洗,去除未反應(yīng)的磁顆粒;將測試卡載入傳感器中讀出磁顆粒數(shù)目,并計(jì)算出磁顆粒數(shù)目與樣品中抗原含量的相關(guān)性。3結(jié)果與討論3.1最佳沖洗時(shí)間和時(shí)間的確定微流體系統(tǒng)中免疫反應(yīng)的效率受到微通道的液體流速、芯片上的表面張力等因素的影響很大。實(shí)驗(yàn)中通過注射泵在微流體通道中依次注入反應(yīng)液和清洗液,從而實(shí)現(xiàn)微流體中的免疫反應(yīng)和沖洗過程。分析條件的優(yōu)化,主要是篩選反應(yīng)試劑的注入速度、免疫反應(yīng)時(shí)間以及芯片表面的沖洗條件。由于儲液室的體積固定,因此對注入速度和沖洗速度的篩選也就是對試劑注入時(shí)間和清洗液注入時(shí)間的篩選。對3種腫瘤標(biāo)志物分別進(jìn)行了篩選,這里僅列出CEA分析條件的篩選過程。設(shè)定緩和的微流體條件和較充分的反應(yīng)時(shí)間(每步15min),篩選出最佳標(biāo)記抗體和磁顆粒溶液的濃度分別為20μg/mL和1mg/mL(10倍稀釋)。在設(shè)定清洗液體積為80μL的條件下,改變清洗液注入時(shí)間,研究沖洗速度對特異反應(yīng)(抗原為1μg/L)和非特異吸附(抗原為0)的影響。如圖3A所示,非特異吸附的磁顆粒數(shù)目隨沖洗時(shí)間的縮短而略有降低,特異反應(yīng)的磁顆粒數(shù)目隨沖洗時(shí)間的縮短而降低,為了獲得最高的信噪比,最優(yōu)的沖洗條件為在60s內(nèi)注入80μL清洗液。芯片表面的免疫反應(yīng)如圖1所示,血樣中的抗原與芯片上的包被抗體的結(jié)合,直接影響最終的免疫夾心結(jié)構(gòu)的形成,因此抗原溶液的靜置時(shí)間,對腫瘤標(biāo)志物的免疫分析有直接而重要的影響。實(shí)驗(yàn)中篩選了含有CEA抗原的血樣的靜置反應(yīng)時(shí)間(圖3B),在1μg/L抗原濃度下,隨靜置反應(yīng)時(shí)間延長,反應(yīng)區(qū)檢測到的磁顆粒數(shù)目增加,10min后增加幅度變小,基本達(dá)到平衡。對標(biāo)記抗體和磁顆粒溶液的靜態(tài)反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行了篩選,由于二者的使用濃度較高,所以反應(yīng)在5min左右基本達(dá)到飽和。由此確定了腫瘤標(biāo)志物免疫分析中三步免疫反應(yīng)的時(shí)間分別為10,5和5min。在微流體傳感器體系中分別篩選了AFP,CEA和CA19-9的測試條件,3種腫瘤標(biāo)志物的最佳反應(yīng)時(shí)間相近,最佳沖洗條件略有差別(表1),故多靶標(biāo)聯(lián)合檢測中選擇60s作為最佳沖洗時(shí)間,使用微流體磁敏生物傳感器,可以在30min內(nèi)同時(shí)進(jìn)行3種腫瘤標(biāo)志物的檢測。3.2腫瘤標(biāo)志物檢測在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件基礎(chǔ)上,在芯片不同測試區(qū)包被不同的第一抗體,同時(shí)測試AFP,CEA和CA19-9腫瘤標(biāo)志物,并繪制成標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(圖4)。在MTJ生物傳感器上可以在30min內(nèi)完成一次多靶標(biāo)測試,AFP、CEA和CA19-9腫瘤標(biāo)志物檢測限可分別達(dá)到0.1μg/L,0.1μg/L和30U/mL,測試線性范圍跨越4個(gè)數(shù)量級,完全滿足了臨床檢測要求。如圖4所示,3種腫瘤標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線在標(biāo)志物低濃度和高濃度區(qū)間內(nèi)有不同的擬合曲線,多靶標(biāo)聯(lián)合檢測的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,在低濃度和高濃度區(qū)間內(nèi),線性良好(相關(guān)系數(shù)均大于0.99),實(shí)際測試時(shí)可根據(jù)磁顆粒信號的數(shù)值選擇相應(yīng)的濃度換算公式。以CEA為靶標(biāo)的不同濃度抗原檢測的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差見表2。結(jié)果表明,本方法能夠滿足臨床上對檢測精密度的要求。使用MTJ微流體磁敏生物傳感器測試臨床血清樣本,并與目前臨床上使用的ELISA測試結(jié)果進(jìn)行相關(guān)分析(圖5),血清CEA,AFP和CA19-9