園藝植物組培基本操作技術(shù)-無菌操作

模塊三組培基本操作技術(shù)項目二無菌操作123CONTENTS接種用品準(zhǔn)備外植體選擇和處理無菌操作項目一無菌操作三、無菌操作（一）接種含義將無菌材料在無菌環(huán)境中切割或分離后轉(zhuǎn)入無菌培養(yǎng)基上的過程。又稱無菌操作。（二）接種方法豎插法橫插法三、無菌操作（三）操作規(guī)程A.接種前4h接種室滅菌;B.接種前20min打開紫外燈;C.接種員洗手，在緩沖間換鞋、穿好實驗服;D.關(guān)紫外燈，開日光燈及風(fēng)機，擦雙手及臺面;E.擦拭接種工具并反復(fù)灼燒，烘烤培養(yǎng)皿;F.接種完，清理臺面并標(biāo)識;三、無菌操作三、無菌操作三、無菌操作三、無菌操作三、無菌操作三、無菌操作項目二無菌操作模塊三組培基本操作技術(shù)12CONTENTS外植體選擇和處理項目二無菌操作3接種用品準(zhǔn)備無菌操作（一）滅菌與消毒的區(qū)別滅菌消毒滅菌：用理化方法殺死物體表面和孔隙內(nèi)一切微生物或生物體。消毒：殺死、消除或抑制部分微生物，使之不發(fā)生作用。思考：滅菌和消毒有何區(qū)別？

一、接種用品準(zhǔn)備物理滅菌過濾滅菌熱力滅菌輻射滅菌干熱滅菌濕熱滅菌電離輻射紫外輻射超聲波微波灼燒滅菌煮沸滅菌烘烤滅菌高壓蒸汽滅菌（二）消毒方法

一、接種用品準(zhǔn)備

一、接種用品準(zhǔn)備

一、接種用品準(zhǔn)備化學(xué)滅菌熏蒸滅菌噴霧滅菌涂擦滅菌浸泡滅菌5-8ml/m3甲醛+5g/m3

高錳酸鉀；或冰醋酸加熱。70%酒精；0.1-0.2%新潔爾滅。各種表面消毒劑同噴霧滅菌

一、接種用品準(zhǔn)備

一、接種用品準(zhǔn)備

1.環(huán)境滅菌◆培養(yǎng)室滅菌◆接種室滅菌（三）組培滅菌方法例舉

一、接種用品準(zhǔn)備接種室滅菌方法超凈臺噴霧消毒:75%酒精。紫外燈照射：波長260nm，距離小于1.2m，20-30min。臭氧滅菌機：1-2h。熏蒸滅菌:5-8ml/m3甲醛+5g/m3高錳酸鉀；冰醋酸；1-3%高錳酸鉀或3%來蘇兒。

一、接種用品準(zhǔn)備培養(yǎng)室滅菌方法新建培養(yǎng)室用前一定要徹底熏蒸1次。隔2-5d用洗衣粉水或3%來蘇水拖地1次，用0.1-1.0%高錳酸鉀液擦架1次。

一、接種用品準(zhǔn)備

2.培養(yǎng)基滅菌高壓濕熱滅菌某些激素、維生素采用過濾滅菌

一、接種用品準(zhǔn)備1.外桶2.鍋蓋3.安全閥4.排氣閥5.氣壓表6.內(nèi)桶7.排氣軟管8.支架手提式高壓濕熱滅菌鍋

一、接種用品準(zhǔn)備手提式高壓濕熱滅菌方法裝鍋加水封蓋通電加熱排冷空氣升溫保壓斷電降壓出鍋冷卻

一、接種用品準(zhǔn)備

自動高壓濕熱滅菌鍋電源水位指示燈溫度、壓力顯示窗溫度壓力設(shè)置鈕壓力表放汽閥

一、接種用品準(zhǔn)備裝鍋加水封外蓋升溫排冷氣升溫保壓降壓出鍋冷卻

自動高壓濕熱滅菌方法通電設(shè)置參數(shù)封內(nèi)蓋

一、接種用品準(zhǔn)備

培養(yǎng)基高壓滅菌所必需的最少時間

容器體積(mL)121℃滅菌所需最少時間(min)

20-5015

100030

250-50025

75-15020

一、接種用品準(zhǔn)備

過濾滅菌濾膜?0.45um以下1.過濾器先滅菌，滅菌溫度不超過121℃。2.溶液先進(jìn)行初濾(濾膜?0.65um)

一、接種用品準(zhǔn)備3.培養(yǎng)用品及器具等的滅菌消毒方法玻璃器皿滅菌接種工具滅菌實驗服、口罩、濾紙滅菌物體表面滅菌玻璃器皿及量具的清洗消毒

一、接種用品準(zhǔn)備玻璃器皿滅菌干熱滅菌：160-180℃,1.5-2.0h濕熱滅菌：121℃,20-40min接種前用酒精棉球擦試消毒，并灼燒滅菌。

一、接種用品準(zhǔn)備接種工具滅菌用前干熱滅菌：160-180℃,1.5-2.0h用前濕熱滅菌：121℃,20-30min接種前用酒精棉球擦試，浸入95%酒精液中，并灼燒滅菌。

一、接種用品準(zhǔn)備濕熱滅菌：121℃,20-30min實驗服滅菌后置于緩沖間或密封好。實驗服、口罩、濾紙滅菌

一、接種用品準(zhǔn)備物體表面滅菌滅菌方式：噴霧、涂抹殺菌消毒劑：70%酒精；1-2%來蘇水；0.1-2%新潔爾滅；洗衣粉；吐溫-80應(yīng)用：桌面、墻面、雙手、材料表面

一、接種用品準(zhǔn)備

復(fù)習(xí)思考題1.滅菌與消毒有何區(qū)別？2.如何理解組培必須建立“無菌概念”？3.組培常用的滅菌方法有哪些？如何滅菌？4.怎樣進(jìn)行培養(yǎng)基的高壓濕熱滅菌?

一、接種用品準(zhǔn)備項目二無菌操作模塊三組培基本操作技術(shù)123CONTENTS接種用品準(zhǔn)備外植體選擇和處理無菌操作項目二無菌操作二、外植體選擇和處理(1)根據(jù)培養(yǎng)目的選擇(2)具有代表性（一）外植體的選擇原則：二、外植體選擇和處理幼嫩莖尖營養(yǎng)芽二、外植體選擇和處理◆選擇優(yōu)良的種質(zhì)（即基因型）＞＞二、外植體選擇和處理◆選擇生理狀態(tài)良好的材料二、外植體選擇和處理◆在生長開始的季節(jié)選取二、外植體選擇和處理◆材料生長健壯、無病蟲害二、外植體選擇和處理◆確定合適的取材部位◆考慮：◆最好做對比試驗來源培養(yǎng)難易培養(yǎng)途徑與變異性二、外植體選擇和處理◆選擇合適的外植體大小培養(yǎng)目的外植體大小胚胎培養(yǎng)或脫毒快速繁殖宜小宜大外植體大小(一般0.5-1.0cm)葉片、花瓣等莖段莖尖分生組織5mm×5mm1-2個莖節(jié)0.2-0.5mm帶1-2葉原基二、外植體選擇和處理（二）接種材料預(yù)處理(1)接種材料預(yù)培養(yǎng)(2)就地套袋(3)接種材料修整與沖洗(4)消毒二、外植體選擇和處理

接種材料修整與沖洗二、外植體選擇和處理消毒70%酒精浸泡10-30s0.1-1%升汞5-8min。用化學(xué)滅菌劑浸潤滅菌，消毒劑處理（可加吐溫活性劑）無菌水沖洗3-10次接種消毒原則：殺死材料表面的全部微生物，又不損傷或只輕微損傷植物材料。消毒液要浸沒材料流水沖洗或洗衣粉漂洗二、外植體選擇和處理滅菌劑使用濃度消毒時間/min去除的難易效果酒精過氧化氫漂白粉次氯酸鈣70%~75%10%~12%飽和溶液9%~10%0.5~25~105~305~30易最易易易好好