白花敗醬草總皂苷對(duì)人宮頸癌hela細(xì)胞抑制作用的機(jī)制研究

白花敗醬草總皂苷對(duì)人宮頸癌hela細(xì)胞抑制作用的機(jī)制研究

白色斑點(diǎn)草是斑點(diǎn)科草本植物的根和紐帶。分布于中國(guó)東部、華亭、華南和西南部。這是一種常見(jiàn)的植物藥。白花敗醬草具有清熱利濕、解毒排膿、活血化瘀、清心安神、改善肝功能、抑菌和抗病毒等作用。關(guān)于黃花敗醬體內(nèi)抗腫瘤,體外誘導(dǎo)人乳腺癌(MCF-7)細(xì)胞凋亡的作用曾有報(bào)道,但白花敗醬草及其總皂苷在抗腫瘤方面的作用,較少報(bào)道。1材料和方法1.1研室培養(yǎng)背景人宮頸癌Hela細(xì)胞株由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)微生物教研室贈(zèng)送;RPMI-1640干粉培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司);新生牛血清(杭州四季青公司);AB8大孔吸附樹(shù)脂購(gòu)于天津南開(kāi)大學(xué)化工廠。1.2方法1.2.1實(shí)驗(yàn)中的材料和處理白花敗醬草購(gòu)于秦皇島市民樂(lè)醫(yī)藥公司,由安國(guó)市昌達(dá)中藥材飲片有限公司提供。1.2.1.敗醬草水提物的制備白花敗醬草粉碎后加適量水,浸泡3h,煮沸提取60min,收集藥液,經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50℃減壓回收得白花敗醬草水提液,真空干燥箱55℃干燥,得敗醬草水提物固體干粉。1.2.1.總皂苷的提取取干燥的白花敗醬草4kg,粉碎,按1∶10用70%食用酒精浸泡4h,加熱回流提取2次,合并濾液減壓回收乙醇,得白花敗醬草乙醇粗提物。此粗提物加入石油醚脫脂,用AB8大孔吸附樹(shù)脂層析分離總皂苷。白花敗醬草醇提物上層析柱后用蒸餾水洗脫至洗脫液中無(wú)糖為止(Molish反應(yīng)陰性)。再分別用30%、50%和70%乙醇洗脫,收集洗脫液,至各洗脫液Liberman-Burchard反應(yīng)陰性為止。洗脫液減壓回收乙醇,真空干燥得淡黃色粗提物,終重量為25.2g,白花敗醬草總皂苷的提取率約為0.63%。皂苷鑒定∶取少量干燥提取物,與濃硫酸-醋酐(1∶20)反應(yīng)顯藍(lán)綠色,證明提取物為甾體皂苷。1.2.2rpmi-1330培養(yǎng)液傳代Hela細(xì)胞培養(yǎng)于含10%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液,置于37℃,50ml/LCO2、飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中孵育,每2～3d傳代。1.2.3指標(biāo)檢測(cè)1.2.3.細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率水提物終濃度分別為0.20,0.40,0.80,1.20mg/ml;皂苷終濃度分別為0.05,0.10,0.15,0.20mg/ml。另設(shè)未加藥物只加細(xì)胞的對(duì)照組,每個(gè)濃度設(shè)三個(gè)復(fù)孔,誘導(dǎo)48h。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組平均OD值/對(duì)照組平均OD值)×100%。根據(jù)各組藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率,運(yùn)用SPSS10.0軟件計(jì)算出藥物半數(shù)抑制濃度(IC50)。1.2.3.陰性對(duì)照組—2光鏡觀察Hela細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征皂苷0.15mg/ml,水提物1.20mg/ml,陰性對(duì)照組培養(yǎng)48h后,磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗,4%多聚甲醛固定,4℃過(guò)夜。蘇木素-伊紅(H-E)染色,光鏡觀察拍照。1.2.3.細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察用皂苷0.15mg/ml處理Hela細(xì)胞48h和72h后,樹(shù)脂包埋,烘烤24h固化成硬塊,切成超薄切片(50nm),醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙重染色后,透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。1.2.3.caspase-3活化程度測(cè)定皂苷終濃度為0.15、0.20mg/ml,水提物終濃度為0.80、1.20mg/ml,每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔,同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照,按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,酶標(biāo)儀測(cè)定OD405值,通過(guò)計(jì)算OD給藥組/OD陰性對(duì)照的倍數(shù)來(lái)確定各組Caspase-3的活化程度。1.3統(tǒng)計(jì)方法應(yīng)用SAS9.13軟件分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示,組間差異的顯著性先方差分析,再采用Dunnet′t檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1化合物缺乏對(duì)hela細(xì)胞的細(xì)胞毒作用總皂苷和水提取物的IC50值分別是59.2μg/ml和199.9μg/ml。根據(jù)美國(guó)國(guó)家癌癥中心(NCI)標(biāo)準(zhǔn):IC50≤230μg/ml可作為抗腫瘤藥物,說(shuō)明白花敗醬草總皂苷和水提物對(duì)Hela細(xì)胞有明顯的細(xì)胞毒作用。見(jiàn)表1,表2。2.2白色斑點(diǎn)草總細(xì)胞闡明了鶴la細(xì)胞的形態(tài)變化2.2.1胞核染色法光鏡下可見(jiàn)對(duì)照組的Hela細(xì)胞生長(zhǎng)良好,細(xì)胞呈多邊形,細(xì)胞質(zhì)多,胞核染色質(zhì)疏松,染色較淡;皂苷0.15mg/ml及水提物1.20mg/ml誘導(dǎo)Hela細(xì)胞48h后,細(xì)胞生長(zhǎng)受到不同程度的抑制,出現(xiàn)胞體變圓,胞質(zhì)起泡,染色質(zhì)凝集深染等。見(jiàn)圖1。2.2.2皂苷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡電鏡下可見(jiàn)對(duì)照組Hela細(xì)胞膜表面有較多微絨毛,染色質(zhì)疏松,核仁明顯。皂苷0.15mg/ml誘導(dǎo)Hela細(xì)胞48h和72h后,可見(jiàn)細(xì)胞變小,細(xì)胞膜表面微絨毛消失,出現(xiàn)早期細(xì)胞凋亡的染色體邊集,細(xì)胞質(zhì)中空泡化明顯,可見(jiàn)含致密染色質(zhì)和細(xì)胞膜的凋亡小體。見(jiàn)圖2。2.3caspase-3活性檢測(cè)Caspase-3活性的影響用白花敗醬草總皂苷和水提物誘導(dǎo)Hela細(xì)胞48h后,各誘導(dǎo)組Caspase-3活性比對(duì)照組均有顯著增高,總皂苷0.15mg/ml和水提物1.2mg/ml激活Caspase-3活性分別是對(duì)照組的3.70和2.42倍。見(jiàn)表3,表4。3抗凋亡能力檢測(cè)有研究表明多種皂苷具有明顯的抗腫瘤活性,本實(shí)驗(yàn)白花敗醬草總皂苷和水提物對(duì)Hela細(xì)胞生長(zhǎng)均有明顯的抑制作用,表明Hela細(xì)胞對(duì)白花敗醬草皂苷的抑制作用敏感,初步確定皂苷是白花敗醬草有效的抗腫瘤活性成分。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡已成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。細(xì)胞凋亡時(shí)具有典型的形態(tài)和生化特征。細(xì)胞凋亡受多種基因調(diào)控,并與Caspases家族和Bcl-2家族密切相關(guān)。Caspases為半胱氨酸天門(mén)冬氨酸蛋白酶的簡(jiǎn)稱(chēng),是一組具有相似氨基酸順序和二級(jí)結(jié)構(gòu)的半胱氨酸蛋白酶,參與細(xì)胞因子成熟、細(xì)胞生長(zhǎng)和分化,還與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。Caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)在凋亡通路中處于重要地位,尤其Caspase-3是其中的中心環(huán)節(jié),Caspase-3被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最關(guān)鍵的效應(yīng)蛋白酶,而Caspase-3催化一些底物的降解是導(dǎo)致染色質(zhì)濃縮的關(guān)鍵步驟。本實(shí)驗(yàn)表明白花敗醬草總皂苷通過(guò)誘導(dǎo)Hela細(xì)胞的凋亡,達(dá)到其抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和增