白花敗醬草抗腫瘤活性部位的篩選

白花敗醬草抗腫瘤活性部位的篩選

雌花草起源于神農(nóng)本草經(jīng)。它分布廣泛，具有清熱除濕、活血化瘀、解毒排膿等功效。白花敗醬出自《本草綱目》,系敗醬科敗醬屬植物白花敗醬PatriniavillosaJuss.的干燥全草,1977年版《中國(guó)藥典》將其收載為正品敗醬草。近年來(lái),敗醬草的抗腫瘤作用日益引起關(guān)注,但對(duì)其抗腫瘤活性部位的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)并不充分,結(jié)論尚不統(tǒng)一。作者通過(guò)白花敗醬草粗提物及大孔樹脂分離各部位對(duì)體外腫瘤細(xì)胞抑制作用的研究,初步篩選并判斷白花敗醬草的抗腫瘤活性部位。1材料表面1.1特芬材料白花敗醬草:購(gòu)自于河北安國(guó)縣藥材市場(chǎng)(批號(hào)20100823),經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)教研室孟祥才副教授鑒定為白花敗醬草正品。1.2藥物、藥品與儀器1640培養(yǎng)基干粉購(gòu)自Gibco公司、胎牛血清購(gòu)自天津?yàn)笊镏破饭?噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自Sigma公司;蘆丁對(duì)照品(上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司,批號(hào):101030);齊墩果酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào):110709-200505);NAPCO公司model5410型CO2培養(yǎng)箱;BioTek公司MQX200型微孔板掃描酶標(biāo)儀;北京普析通用儀器有限責(zé)任公司TU-1901型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì);梅特勒托利多公司MET-TLERAE240型電子分析天平;AB-8型大孔吸附樹脂(滄州寶恩吸附材料科技有限公司)。1.3細(xì)胞株的選擇人宮頸癌細(xì)胞Hela細(xì)胞株、人乳腺癌細(xì)胞Mcf-7細(xì)胞株、人肝癌細(xì)胞Bel-7402細(xì)胞株、人膀胱癌細(xì)胞EJ細(xì)胞株和人結(jié)腸癌細(xì)胞Hct-8細(xì)胞株均購(gòu)自于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心。在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液、飽和濕度、飽和溫度為37℃,CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2方法2.1粗提物的制備將白花敗醬草干燥全草截?cái)嗉s0.5cm長(zhǎng)度后,稱取100g藥材,用10倍量70%乙醇水加熱回流1.5h,共2次。合并提取液減壓回收溶劑后,得浸膏,凍干后得粗提物凍干粉7.01g。在層析柱(Φ4cm×H30cm)中裝入經(jīng)過(guò)預(yù)處理的300gAB-8型大孔吸附樹脂,干法上樣。依次用5倍柱體積的水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇和80%乙醇洗脫,分別減壓濃縮,凍干后得各部位。根據(jù)徐潔昕的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)白花敗醬草的粗提物及5個(gè)樹脂部位的總皂苷和總黃酮進(jìn)行含量測(cè)定。2.2白色斑點(diǎn)草提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用2.2.1dmso濃度精密稱取白花敗醬草粗提取物10mg,加磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解至5g·L-1,用含10%滅活新生小牛血清RAPM1640培養(yǎng)基將其稀釋成10,50,250,1250mg·L-1溶液,過(guò)濾除菌,4℃保存?zhèn)溆?。精密稱取白花敗醬草各部位10mg,用DMSO溶解,用培養(yǎng)液稀釋至10ml,制成1g·L-1溶液。再用培養(yǎng)液稀釋成2,10,50,250mg·L-1溶液。DMSO最終濃度小于0.05%,在該濃度下DMSO對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)影響。過(guò)濾除菌,4℃保存?zhèn)溆?。精密稱取H2O部位10mg,用培養(yǎng)液溶解并稀釋至10ml,制成1g·L-1溶液。再用培養(yǎng)液稀釋,分別配制成2,10,50,250mg·L-1溶液,過(guò)濾除菌,4℃保存?zhèn)溆谩?.2.2測(cè)定指標(biāo)及方法采用四甲基偶氮唑藍(lán)比色法。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela、Mcf-7、Bel-7402、EJ、和Hct-8細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度至3×104個(gè)/ml,分別接種于96孔板上,每孔100μl。培養(yǎng)24h后加藥,對(duì)照調(diào)零組加入100μl培養(yǎng)基作本底,實(shí)驗(yàn)組分為空白對(duì)照組和受試藥組,每組設(shè)三個(gè)復(fù)孔。受試藥組藥物終濃度為50μg·ml-1,終體積為200μl,空白對(duì)照組加入等體積RAPM1640不完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束前4h,每孔加入20μl濃度為5mg·L-1的MTT。培養(yǎng)結(jié)束后,小心吸棄培養(yǎng)基,每孔加入DMSO(二甲基亞砜)150μl,輕輕震蕩10min后,用酶標(biāo)儀于570nm處測(cè)定吸光度(A)值,測(cè)定時(shí)需減去空白對(duì)照的A值。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=(1-A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組)×100%3結(jié)果3.1表1顯示了粗提物及其各部分中總羥基磺酸和總黃酮的含量3.2ic50值,當(dāng)對(duì)于白花敗醬草粗提物,Mcf-7細(xì)胞最敏感,IC50值達(dá)22mg·L-1。Hela細(xì)胞、Hct-8細(xì)胞和EJ細(xì)胞次之,Bel-7204細(xì)胞較差。結(jié)果見(jiàn)表2。3.3樹脂組織部位對(duì)hela和mcf-7和hct-8細(xì)胞生物抑制作用的影響濃度為250mg·L-1的80%乙醇樹脂部位對(duì)Hela、MCF-7、HCT-8和EJ細(xì)胞的抑制率都達(dá)到80%以上,IC50值均小于100mg·L-1。20%乙醇樹脂部位和H2O樹脂部位對(duì)Hela、MCF-7和HCT-8細(xì)胞的抑制率很弱,IC50值均大于250mg·L-1。由此可知白花敗醬草的抗腫瘤活性主要集中在80%樹脂部位。結(jié)果見(jiàn)表3。4體外抗腫瘤活性近年來(lái)研究表明敗醬屬植物具有一定的抗腫瘤作用,其含有的黃酮醇、齊墩果酸、多糖、異香豆素糖苷和揮發(fā)油等活性成分在體外能抑制人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖。但是,目前針對(duì)白花敗醬草的抗腫瘤活性部位說(shuō)法不一,其皂苷部位、黃酮部位以及水提液部位已被證實(shí)具有一定的藥理活性。如張永強(qiáng)等研究了敗醬草通過(guò)正丁醇萃取的總皂苷部位對(duì)U14荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤的抑制作用,并推測(cè)敗醬草皂苷通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力而清除體內(nèi)過(guò)多的氧自由基而達(dá)到抗腫瘤作用。楊曉蕾實(shí)驗(yàn)得出白花敗醬草乙酸乙酯萃取獲得的總黃酮部位具有體外誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡作用和對(duì)U14荷瘤小鼠的體內(nèi)抗腫瘤活性。陳磊等實(shí)驗(yàn)說(shuō)明白花敗醬草水提液可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞損傷。鑒于白花敗醬草的抗腫瘤活性部位處于不明確狀態(tài),作者建立70%醇提后經(jīng)大孔樹脂分離的純化工藝,將白花敗醬中的總黃酮和總皂苷部位盡量分開,利用紫外顯色法測(cè)定各部位總黃酮和總皂苷含量,之后采用MTT法分別進(jìn)行抗腫瘤細(xì)胞的篩選以及抗腫瘤活性部位的考察,更直觀地篩選出總皂苷是白花敗醬草的抗腫瘤活性部位。本實(shí)驗(yàn)選擇Hela、Mcf-7、EJ、Hct-8和Bel-7402五種人腫瘤細(xì)胞系,針對(duì)白花敗醬草粗提物分別考察了這五種腫瘤細(xì)胞的敏感性。本研究中MTT試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對(duì)于白花敗醬草粗提物,Hela、Mcf-7、EJ和Hct-8細(xì)胞株具有一定的敏感性,IC50值均小于250mg·L-1,其中Mcf-7細(xì)胞和Hela細(xì)胞最為敏感,IC50值分別是22mg·L-1和57mg·L-1。提示其藥理作用可能主要表現(xiàn)在抑制婦科腫瘤宮頸癌和乳腺癌方面。同時(shí)分別設(shè)計(jì)了10,50,250,1250mg·L-1四個(gè)濃度考察粗提物的腫瘤細(xì)胞抑制率,發(fā)現(xiàn)粗提物在抑制腫瘤細(xì)胞體外增殖方面具有一定的劑量-效應(yīng)依賴性。因此,本課題組對(duì)粗提物進(jìn)一步分離純化,通過(guò)體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?篩選白花敗醬草的抗腫瘤活性部位并客觀評(píng)價(jià)其抗腫瘤活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,80%乙醇樹脂部位對(duì)Hela、Mcf-7、EJ和Hct-8細(xì)胞株的IC50值較粗提物均明顯降低,并且對(duì)Hela和Mcf-7細(xì)胞株的抑制效果最明顯,IC50值分別為11.9mg·L-1和12.55mg·L-1。此外20%樹脂部位和H2O樹脂部位對(duì)Hela、Mcf-7和EJ雖具有一定的抑制作用,但其抑制率較低,IC50值均大于250mg·L-1。綜合以上結(jié)果,80%乙醇樹脂部位對(duì)Hela和Mcf-7細(xì)胞株具有顯著的抑制作用,提示80%乙醇樹脂部位可作為白花敗醬草的抗婦科腫瘤的有效部位。顯色法測(cè)得活性部位的總皂苷和總黃酮的含量分別是61.81%和8.69%,因此可確定總皂苷部位是白花敗醬草抗婦科腫瘤有效部位。本試驗(yàn)通過(guò)白花敗醬草總皂苷對(duì)人體腫瘤細(xì)胞抑制率的考察,明確了白花敗醬草總皂苷的抗婦科腫瘤活性,填補(bǔ)了其總皂苷抗腫瘤的體外研究數(shù)據(jù)的空白。另外,本試驗(yàn)中黃酮成分主要集中在40%乙醇樹脂部位,其總黃酮含量達(dá)51.61%。MTT試驗(yàn)結(jié)果顯示此部位對(duì)Hela、Mcf-7、EJ和Hct-8細(xì)胞株均無(wú)明顯的抑制作用。此試驗(yàn)結(jié)果與楊曉蕾等人的試驗(yàn)結(jié)果不同,作者分析其原因,可能是因?yàn)樘崛》椒ú煌斐傻摹＝陙?lái),婦女宮頸癌和乳腺癌的發(fā)病率逐漸上升,其治療費(fèi)用