響應(yīng)面法優(yōu)化米曲霉發(fā)酵米糠條件

響應(yīng)面法優(yōu)化米曲霉發(fā)酵米糠條件

大米是大米加工的副產(chǎn)品。中國的大米年產(chǎn)量超過1000萬噸，但美國的有效利用還不到20%。米糠中蛋白質(zhì)含量為12%~18%,是大米的一倍。多肽是蛋白質(zhì)水解的產(chǎn)物,具有抗氧化、降血壓、降低膽固醇含量以及促進鈣吸收等功能。米糠蛋白是一種優(yōu)質(zhì)蛋白,其水解的多肽具有重要生理功能。研究表明,大米蛋白的堿性蛋白酶水解產(chǎn)物能抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(AEC)的活性。有學(xué)者從米糠蛋白的蛋白酶水解產(chǎn)物中分離出了類阿片拮抗肽。目前,米糠多肽主要通過酶法水解米糠蛋白獲得,且不同的酶水解所獲得的活性肽不同。采用微生物發(fā)酵生產(chǎn)米糠多肽的研究報道較少。微生物在培養(yǎng)過程中可以產(chǎn)生各種蛋白酶,使蛋白質(zhì)降解,提高多肽的產(chǎn)率,并且獲得功能更多的小肽。另外,利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)米糠多肽可以降低生產(chǎn)成本,適于工業(yè)化生產(chǎn)。本研究通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)米糠多肽,并分析多肽分子量分布規(guī)律及其活性,為米糠蛋白的深度開發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1菌種與培養(yǎng)基米糠來源南陵大米加工廠。葡聚糖凝膠G-25Pharmacia公司;輔酶Ⅰ、谷胱甘肽、Gly-Gly-Tyr-Arg四肽Sigma公司;三氯乙酸、DPPH、H2O2、鄰二氮菲、硫酸亞鐵、氫氧化鈉、硫酸銅、水楊酸、乙醇,酪氨酸國藥集團試劑公司,為分析純。菌種與培養(yǎng)基:米曲霉(Aspergillusoryzae,AS3.951)中國科學(xué)院微生物保藏中心,種子培養(yǎng)基(PDF):馬鈴薯汁1000mL,葡萄糖20g,自然pH。發(fā)酵培養(yǎng)基:米糠溶液添加KH2PO4和MgSO4121℃滅菌20min。754紫外可見分光光度計,YX5-A臺式離心機上海儀器有限公司;HZ-9310KB恒溫搖床,HH-4恒溫水浴鍋江蘇杰瑞爾電器有限公司。1.2實驗方法1.2.1處理過的米魯賓1.2.2米糠基培養(yǎng)將菌種在PDF斜面培養(yǎng)基上活化,然后從斜面挑取孢子接種至PDF液體培養(yǎng)基中,于28℃下培養(yǎng)72h后備用。以米糠為基本培養(yǎng)基,250mL三角瓶,每瓶裝液量為100mL,米糠添加量為5g,按體積分數(shù)接種米曲霉種子液,120r/min搖床培養(yǎng)。將發(fā)酵液于5000r/min離心10min,上清液經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾,濾液分成兩份,一份測定多肽含量,另一份測定發(fā)酵液的蛋白酶活力。1.2.3單因素實驗設(shè)計固定接種量5%、pH6、培養(yǎng)溫度28℃和培養(yǎng)時間48h,在其他條件不變的情況下,以蛋白酶活力和多肽含量為指標(biāo),選取培養(yǎng)時間為72h,在不同時間段測定蛋白酶活力和多肽含量,接種量為1%、5%、10%、15%、20%、25%,培養(yǎng)溫度為20、25、30、35、40、45℃,起始pH為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0進行單因素實驗,每組實驗進行3次平行。1.2.4響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件根據(jù)BoxBenhnken的中心組合實驗設(shè)計原理,綜合單因素實驗結(jié)果,選取發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、接種量影響顯著的3個因素,在單因素實驗基礎(chǔ)上采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法,因素與水平見表1。1.2.5r-arg-標(biāo)準(zhǔn)溶液制備蛋白酶活用Folin法測定,酶活力定義為:每mL發(fā)酵液每分鐘催化產(chǎn)生1μg酪氨酸所需的酶量為1個酶活單位U(μg/mL·min)。多肽含量測定用三氯乙酸法,配制Gly-GlyTyr-Arg四肽標(biāo)準(zhǔn)溶液,以肽的濃度為橫坐標(biāo)X(mg/mL),OD值為縱坐標(biāo)Y,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程y=0.0368x+0.003,R2=0.9993。將等體積的三氯乙酸(10%)加入到發(fā)酵液中,靜置10min,然后在5000r/min下離心15min,在上清液中加入一定量的雙縮脲試劑(樣液∶雙縮脲試劑=3∶2,V/V),于漩渦混合儀上混合均勻,靜置10min,2000r/min離心10min,取上清液于540nm下測定OD值,對照標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品溶液中的多肽量。米糠多肽含量(mg/g)=發(fā)酵液中多肽量/米糠質(zhì)量。1.2.6洗脫液的收集米糠多肽分子量測定參照文獻略作改動。米糠發(fā)酵上清液經(jīng)超濾膜過濾后(截留分子量大于2000u),取1mL濾液上柱(SephadexG-25),以蒸餾水為洗脫液,洗脫速度為40mL/h,用自動部分收集器收集洗脫液,每管收集3mL,在238nm處檢測流出液。以輔酶Ⅰ(MW663.45),Gly-Gly-Tyr-Arg(MW451.48),谷胱甘肽(MW307.32)為參照物,標(biāo)準(zhǔn)分子量的常用對數(shù)與管數(shù)之間的關(guān)系曲線為:n=374.2-122.6logMW。1.2.7吸光度測定羥基自由基清除能力測定參考Smirnoff的方法稍作修改。將米糠多肽配成不同濃度的溶液,在離心管中依次加入1mL9mmol/L的FeSO4,1mL不同濃度的多肽溶液,1mL9mmol/LH2O2,搖勻靜置10min,再加入1mL9mmol/L的水楊酸和乙醇溶液搖勻,于37℃保溫30min,5000r/min離心10min,取上清液在510nm處測定吸光值A(chǔ)X。以等體積的水代替多肽為空白對照組測定吸光值A(chǔ)0,以等體積水代替水楊酸為樣品對照組測定吸光值A(chǔ)X0,VC為陽性對照,1.2.8dpph-ms法檢測meDPPH自由基清除能力測定參考Blois的方法稍作修改。把米糠多肽配成不同濃度的溶液,分別取1mL不同濃度的多肽溶液至離心管中,再分別加入2mL0.05mmol/L的DPPH溶液,混合均勻于25℃避光反應(yīng)30min,在517nm處測定吸光值A(chǔ)X。對照組用等體積的95%的乙醇代替DPPH溶液測定吸光值A(chǔ)X0,空白用等體積的蒸餾水代替多肽溶液測定A0,VC為陽性對照,1.3數(shù)據(jù)分析方法原始數(shù)據(jù)采用origin8.5完成,實驗數(shù)據(jù)采用PPS7.01軟件進行統(tǒng)計分析;采用DesignExpert7.1.6軟件對中心組合設(shè)計實驗數(shù)據(jù)進行回歸分析。每組實驗做三次平行實驗,圖中的數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。2結(jié)果與分析2.1米曲霉產(chǎn)酶量的變化從圖1可以看出,在發(fā)酵16h之前,蛋白酶活力很低,40~48h時,酶活力趨于穩(wěn)定,平均酶活力為92.6U,48h后,酶活力逐漸下降。在16h之前,多肽含量很低,48h達到最大,之后多肽含量增加緩慢。米曲霉接種到培養(yǎng)基中要經(jīng)過延遲期、對數(shù)生長期、穩(wěn)定期和衰退期等階段。在延遲期米曲霉生長緩慢,產(chǎn)酶量很低,達到40h后,米曲霉進入穩(wěn)定期,產(chǎn)酶能力最佳,衰退期產(chǎn)酶量降低。多肽含量與蛋白酶密切相關(guān),在延遲期蛋白酶產(chǎn)量很低,多肽含量也很低,隨著產(chǎn)酶量的增加,多肽含量也增加,在發(fā)酵后期,多肽含量降低,可能培養(yǎng)時間過長,多肽被微生物消耗,因此發(fā)酵最佳時間為48h,此時多肽含量為112.2mg/g。2.2接種量對蛋白質(zhì)活力和多肽含量的影響從圖2可以看出,隨著接種量的增加,蛋白酶活力和多肽含量均增加,當(dāng)接種量為15%時,蛋白酶活力和多肽含量達到最大,分別為96.5U和121.6mg/g,繼續(xù)增加接種量蛋白酶活力和多肽含量有所下降,這是由于接種量過高,發(fā)酵前期菌體生長過快,導(dǎo)致發(fā)酵后期營養(yǎng)不足而使菌體自溶,使多肽含量降低,因此接種量15%較為適宜。2.3不同溫度對多肽含量的影響從圖3中可以看出,隨著溫度的升高,蛋白酶活性升高,多肽含量也提高。當(dāng)溫度達到30℃時,多肽含量達到122.8mg/g;繼續(xù)升高溫度,蛋白酶活力降低,多肽含量也降低,所以培養(yǎng)溫度30℃為宜。2.4肽含量的測定由圖4可知,隨著pH的升高,蛋白酶活性增加,多肽含量也有所提高。當(dāng)pH為5.5時,多肽含量最高為121.4mg/g,繼續(xù)提高pH,多肽含量降低,可能pH升高降低蛋白酶活性,從而影響多肽的產(chǎn)生。2.5反應(yīng)域優(yōu)化實驗2.5.1數(shù)據(jù)回歸分析選用中心組合模型,做3因素3水平共15個實驗點的響應(yīng)面分析實驗。15個實驗點分為兩類:1~12個是析因點;13~15個是零點,為區(qū)域的中心點,零點實驗重復(fù)3次,用以估計實驗誤差。米糠多肽含量為響應(yīng)值,實驗結(jié)果見表2。根據(jù)表2的實驗結(jié)果,采用DesignExpert7.1.6軟件對實驗數(shù)據(jù)進行回歸分析,求出影響因素的一次效應(yīng)、二次效應(yīng)及其交互效應(yīng)的關(guān)聯(lián)方程,對米糠多肽的影響因素進行更深入的研究和條件優(yōu)化,并做出響應(yīng)面圖。多元回歸擬合分析得到米糠多肽含量與各因素變量的二次方程模型為:米糠多肽含量Y=130.2+7.743X1-2.152X2+2.113X3-1.385X1X2-2.672X1X3-1.914X2X3-2.155X12-1.175X22-2.161X32從方差分析表3可以看出,用上述回歸方程描述各因素與響應(yīng)面之間的關(guān)系,其因變量和全體自變量之間的線性關(guān)系顯著,其中發(fā)酵時間和溫度顯著,接種量不是很顯著。從回歸方程各項的方差分析結(jié)果還可以看出,可用該回歸方程代替實驗真實點對實驗結(jié)果進行分析和預(yù)測。2.5.2最優(yōu)工藝條件的確定圖5直觀地反映了各因素對響應(yīng)值的影響,比較圖5中的3個圖可知:發(fā)酵溫度X1、發(fā)酵時間X3對米糠多肽得率的影響顯著,表現(xiàn)為曲線相對較陡;而接種量X2表現(xiàn)為曲線較為平滑,響應(yīng)值變化較小。發(fā)酵時間和溫度以及發(fā)酵時間和接種量之間有交互作用,其中發(fā)酵時間和接種量之間的交互作用顯著(p<0.05)。根據(jù)所得的模型,可預(yù)測在穩(wěn)定狀態(tài)下的最優(yōu)工藝條件為:發(fā)酵時間為48.6h,發(fā)酵溫度為29.5℃,接種量為14.6%,米糠多肽含量理論可達到129.5mg/g。進行3次平行實驗驗證,米糠多肽平均含量為128.4mg/g,與理論預(yù)測值接近,說明優(yōu)化結(jié)果可靠。2.6分子量肽研究結(jié)果采用超濾和SephadexG-25進行層析分離發(fā)酵液,分子量參照物與發(fā)酵液層析結(jié)果如圖6所示。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,由出峰管數(shù)推測出分子量分布范圍,并采用面積歸一法對不同分子量肽的含量進行定量分析,結(jié)果見表4。由圖6B和表4可知,米曲霉發(fā)酵米糠過程中,在發(fā)酵液中存在大小不等的多肽,分子量主要集中在500~800u之間,含量為75.6%,其中峰Ⅰ的平均分子量為1221u,峰Ⅱ的平均分子量為682u,峰Ⅲ的平均分子量為638u,峰Ⅳ的平均分子量為578u。2.7自由基的能力羥基自由基清除能力如圖7所示。分離的四種米糠多肽均具有清除羥基自由基的能力。隨著多肽濃度的增加,樣品對羥基自由基的清除率也隨之增加,當(dāng)多肽濃度達到2.5mg/mL時,峰Ⅱ所獲得的多肽對羥基自由基的清除率達到86.2%,但低于對照VC的清除率。2.8峰對dpph自由基的清除率米糠多肽的DPPH清除能力如圖8所示。從圖8可以看出,分離的四種米糠多肽均具有一定的DPPH清除能力,其中峰Ⅳ所獲得的多肽效果最好,隨著多肽濃度的增加,樣品對DPPH自由基清除率也隨之增加,當(dāng)多肽濃度為2.5mg/mL時