第14章-維生素類藥物的分析

維生素類藥物的分析第十四章維生素FrederickGowlandHopkin

ChristiaanEijkman

1929NobelPrizeGeorgeWald

1967NobelPrize教學(xué)目標(biāo)掌握維生素A與維生素B1的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及鑒別試驗(yàn)；熟悉紫外三點(diǎn)校正法測定維生素A含量的原理及計(jì)算；分類

VitA、D2、D3、E、K1

等

脂溶性水溶性

VitB族(B1、B2、B6、B12)VitC、葉酸、煙酸、泛酸等。按溶解度分維生素A結(jié)構(gòu)-H維生素A醇-COCH3維生素A醋酸酯-COC15H31維生素A棕櫚酸酯R:結(jié)構(gòu)VitA2VitA3結(jié)構(gòu)鯨醇結(jié)構(gòu)與性質(zhì)溶解性紫外吸收不穩(wěn)定性與三氯化銻反應(yīng)325~328nm結(jié)構(gòu)與性質(zhì)

△或有金屬離子存在時(shí)氧化↑共軛多烯側(cè)鏈：易被氧化環(huán)氧化物VitA醛VitA酸結(jié)構(gòu)與性質(zhì)鑒別試驗(yàn)三氯化銻反應(yīng)(Carr-Price反應(yīng))條件：無水無醇CHCl3紫紅藍(lán)色??????3SbClVitA鑒別試驗(yàn)鑒別試驗(yàn)維生素AChP（2010）[鑒別]取本品1滴，加三氯甲烷10ml振搖使溶解；取2滴，加三氯甲烷2ml與25%三氯化銻的三氯甲烷溶液0.5ml，即顯藍(lán)色，漸變成紫紅色。三氯化銻反應(yīng)鑒別試驗(yàn)（BP（2000））UV法λmax為326nm一個(gè)吸收峰λmax為350～390nm三個(gè)吸收峰鑒別試驗(yàn)鑒別試驗(yàn)USP顯色劑磷鉬酸規(guī)定斑點(diǎn)顏色和Rf值BP

對(duì)照品法顯色劑三氯化銻TLC法含量測定立體異構(gòu)體氧化降解產(chǎn)物合成中間體UV法(三點(diǎn)校正法)維生素A2維生素A3環(huán)氧化物維生素A醛維生素A酸含量測定維生素A的含量用生物效價(jià)即國際單位（IU/g）來表示。規(guī)定：效價(jià)1IU=0.344μg

全反式維生素A醋酸酯1IU=0.300μg

全反式維生素A醇每1g全反式維生素A醋酸酯/醇相當(dāng)于多少國際單位？含量測定換算因子意義：單位E數(shù)值所相當(dāng)?shù)男r(jià)。%1cm含量測定含量測定含量測定三點(diǎn)校正法（法定方法）1.原理：（1）雜質(zhì)的吸收在310-340nm波長范圍內(nèi)呈一條直線，且隨波長的增大吸收度減?。唬?）物質(zhì)對(duì)光的吸收具有加和性。含量測定2.波長的選擇：（1）

1

VitA的

max（328nm或325nm）（2）

2

3

分別在

1的兩側(cè)各選一點(diǎn)含量測定測定對(duì)象：VitA醋酸酯=12nm測定對(duì)象：VitA醇

1=325nm,2=310nm,3=334nm第一法:等波長差法第二法:等吸收比法含量測定測定法（1）基本步驟:第一步A的選擇選擇依據(jù)：所選A值中雜質(zhì)的干擾已基本消除。含量測定第二步求注意：

C為混合樣品的濃度

第三步求效價(jià)含量測定第四步：求標(biāo)示量％含量測定

方法：（2）

第一法維生素A醋酸酯含量測定

判斷

是否在326～329nm之間在326～329nm之間改用第二法是否

求算

并與規(guī)定值比較含量測定

規(guī)定值差值

判斷差值是否超過規(guī)定值的有一個(gè)以上超過無超過

計(jì)算

A328（校正）

用A328計(jì)算含量測定含量測定03%－15%－3%第二法第二法含量測定含量測定適用于維生素A醇（等吸收比法）

第一法無法消除雜質(zhì)干擾時(shí)用此法[皂化法、6/7A法]（3）第二法含量測定水溶性脂溶性含量測定

判斷

max是否在323～327nm之間取未皂化樣品采用色譜法純化后再測定

計(jì)算是否含量測定

判斷A300/A325

是否大于0.73是否取未皂化樣品采用色譜法純化后再測定

計(jì)算A325(校正)含量測定含量測定03%－3%含量測定

VitAD膠丸中VitA的含量測定精密稱取本品(規(guī)格10000VitAIU/丸)裝量差異項(xiàng)下（平均裝量0.07985g/丸）的內(nèi)容物0.1287g至10ml燒杯中，加環(huán)己烷溶解并定量轉(zhuǎn)移至50ml量瓶中，用環(huán)己烷稀釋至刻度，搖勻；精密量取2.0ml，置另一50ml量瓶中，用環(huán)己烷稀釋至刻度，搖勻。以環(huán)己烷為空白，測定最大吸收波長為328nm，并在下列波長處測得吸收度為含量測定A300：0.374A316

：0.592A328：0.663A340：0.553A360：0.228A300/A328：0.564A316/A328：0.893A328/A328：1.000A340/A328：0.834A360/A328：0.344

求本品中維生素A占標(biāo)示量的百分含量？A300/A328：0.564A316/A328：0.893A328/A328：1.000A340/A328：0.834A360/A328：0.344

0.5550.9071.0000.8110.299

+0.01－0.010+0.02+0.04－－－－－=====A328(校正)=3.52(2A328-A316-A340)=3.52(2×0.663–0.592–0.553)=0.637含量測定A328(校正)–A328(實(shí)測)A328(實(shí)測)×100=0.637–0.6630.663×100=-3.92E1%1cm(328nm)=A328(校正)100ms/D=0.637100×0.1287/1250=61.87含量測定供試品中維生素A效價(jià)=

E1%1cm(328nm)×1900=61.87×1900=117553（IU/g）標(biāo)示量%=VA效價(jià)(IU/g)×每丸內(nèi)容物平均裝量(g/丸)標(biāo)示量(IU/丸)×100%=117553×0.0798510000×100%=93.9%含量測定含量測定三氯化銻比色法：優(yōu)點(diǎn)：簡便、快速λmax618nm～620nm標(biāo)準(zhǔn)曲線法缺點(diǎn)呈色不穩(wěn)定（5～10s內(nèi)）水分干擾與標(biāo)準(zhǔn)曲線溫差≤1℃專屬性差三氯化銻有腐蝕性藍(lán)色+3SbClVitA氨基嘧啶環(huán)－CH2－噻唑環(huán)(季銨堿)HClCl-結(jié)構(gòu)維生素B1（硫胺）12345615432結(jié)構(gòu)與性質(zhì)溶解性紫外吸收硫色素反應(yīng)氯化物、硫元素λmax=246nm與生物堿沉淀劑反應(yīng)鑒別試驗(yàn)維生素B1ChP（2010）[鑒別]

(1)取本品約5mg，加氫氧化鈉試液2.5ml溶解后，加鐵氰化鉀試液0.5ml與正丁醇5ml，強(qiáng)力振搖2分鐘，放置使分層，上面的醇層顯強(qiáng)烈的藍(lán)色熒光；加酸使成酸性，熒光即消失；再加堿使成堿性，熒光又顯出。硫色素?zé)晒夥磻?yīng)硫色素O環(huán)合-2H鑒別試驗(yàn)生物堿沉淀劑反應(yīng)VitB1K2HgI4黃色I(xiàn)2-KI紅色硅鎢酸白色苦酮酸白色扇形鑒別試驗(yàn)氯化物反應(yīng)(Chp2010)硫元素反應(yīng)含量測定電位滴定法（一）非水減量法反應(yīng)摩爾比為1：2含量測定（二）UV含量測定含量測定片劑、注射劑=421（每片）相當(dāng)于標(biāo)示量的%=A=ECL規(guī)格g/片gChP2010WEA%cmD10011××%100標(biāo)示量平均片重××含量測定（每ml）相當(dāng)于標(biāo)示量的%=規(guī)格g/mlml%VEA%cm100110011×標(biāo)示量稀釋倍數(shù)××含量測定原理熒光硫色素異丁醇鐵氰化鉀1VitBNaOH（三）硫色素?zé)晒夥║SP含量測定方法（三）硫色素?zé)晒夥║SP配氧化試劑、對(duì)照品、供試品溶液測定對(duì)照品供試品空白計(jì)算特點(diǎn)（1）靈敏度高，線性范圍寬（2）代謝產(chǎn)物不干擾，適用于體液分析含量測定結(jié)構(gòu)L－抗壞血酸維生素C結(jié)構(gòu)與性質(zhì)1、易溶于水2、水溶液呈酸性溶解性結(jié)構(gòu)與性質(zhì)C3－OH的pKa=4.17C2－OH的pKa=11.57一元酸酸性結(jié)構(gòu)與性質(zhì)二烯醇結(jié)構(gòu)二酮基結(jié)構(gòu)二烯醇結(jié)構(gòu)還原性結(jié)構(gòu)與性質(zhì)有活性有活性無活性結(jié)構(gòu)與性質(zhì)△糖類的顯色反應(yīng)50℃結(jié)構(gòu)與糖類相似具有糖的性質(zhì)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)L(+)－抗壞血酸活性最強(qiáng)手性C（C4、C5）**光學(xué)活性結(jié)構(gòu)與性質(zhì)與堿反應(yīng)水解性結(jié)構(gòu)與性質(zhì)鑒別試驗(yàn)去氫抗壞血酸]O[VitC與氧化劑的反應(yīng)鑒別試驗(yàn)1、與AgNO3反應(yīng)2、與2，6-二氯靛酚反應(yīng)(ChP2010)氧化型玫瑰紅色還原型藍(lán)色OHˉ(ChP2010)（玫瑰色）（無色）鑒別試驗(yàn)3.其他氧化劑的反應(yīng)：亞甲藍(lán)或高錳酸鉀試劑褪色

堿性酒石酸銅磚紅色沉淀

磷鉬酸鉬藍(lán)

鑒別試驗(yàn)或鹽酸50℃吡咯USP鑒別試驗(yàn)糖類的反應(yīng)鑒別試驗(yàn)（藍(lán)色）(糠醛)（戊糖）50℃(吡咯)BP0.01mol/LHCl鑒別試驗(yàn)UV薄層色譜法Chp2010VitC制劑1.溶液的澄清度與顏色：有色雜質(zhì)分光光度法

2.鐵、銅離子：原子吸收分光光度法3.草酸：比濁雜質(zhì)檢查含量測定指示劑淀粉指示液碘量法原理含量測定H+含量測定

取本品約0.2g，精密稱定，加新沸過的冷水100ml與稀醋酸10ml使溶解，加淀粉指示液1ml，立即用碘滴定液（0.1mol/L）滴定，至溶液顯藍(lán)色，在30秒內(nèi)不褪。每1ml碘滴定液(0.1mol/L)相當(dāng)于8.806mg的C6H8O6。方法含量測定（1）酸性環(huán)境（2）新沸冷H2O減慢VitC被O2氧化速度（3）立即滴定

趕走水中O2減少O2的干擾方法（4）附加劑干擾的排除片劑——滑石粉——過濾注射劑——抗氧劑——丙酮甲醛Na2SO3NaHSO3

Na2S2O3Na2S2O5含量測定CHHOOaS3aSO+H2NHON2252HONHCOS3a含量測定USPJP酚亞胺二氯靛酚，-62VitC含量測定2,6-二氯靛酚鈉滴定法原理自身指示終點(diǎn)法含量測定方法（2）快速滴定2min內(nèi)（1）酸性環(huán)境HPO3-HAc穩(wěn)定VitC防止其他還原性物質(zhì)干擾（3）剩余比色測定（定量過量）（測剩余染料）含量測定討論（4）缺點(diǎn)

需經(jīng)常標(biāo)定貯存≤一周不穩(wěn)定干擾多氧化力較強(qiáng)含量測定苯并－二氫吡喃醇結(jié)構(gòu)維生素E12345678名稱R1R2相對(duì)活性α-生育酚β-生育酚γ-生育酚δ-生育酚CH3CH3HHCH3HCH3H1.00.50.20.1***結(jié)構(gòu)dl－α－生育酚醋酸酯結(jié)構(gòu)苯環(huán)+二氫吡喃環(huán)+飽和烴鏈1、UV2、乙?；姆恿u基易水解]O[醌型化合物△生育酚-+orOHHVitE雜質(zhì)，需檢查結(jié)構(gòu)與性質(zhì)鑒別試驗(yàn)]O[生育紅硝酸反應(yīng)橙紅色75℃15′HNO3VitE生育酚（橙紅色）生育紅生育酚HNO3鑒別試驗(yàn)強(qiáng)氧化劑鑒別試驗(yàn)三氯化鐵－聯(lián)吡啶反應(yīng)生育酚對(duì)-生育醌[O]弱氧化劑鑒別試驗(yàn)血紅色鑒別試驗(yàn)

=41.0～45.5λmax=284nmλmin=254nm0.01%無水乙醇中UV鑒別試驗(yàn)薄層板硅膠G展開劑環(huán)己烷-乙醚（4：1）顯色劑硫酸（105℃5′）VitERf

=0.7-生育酚Rf

=0.5-生育醌Rf

=0.9鑒別試驗(yàn)薄層色譜法游離生育酚

原理酸度以NaOH滴定液（0.1mol/L）體積控制。雜質(zhì)檢查（M生育酚=430.8）

取本品0.10g，加無水乙醇5ml溶解后，加二苯胺試液1滴，用硫酸鈰液（0.01mol/L）滴定，消耗硫酸鈰液（0.01mol/L）不得過1.0ml。例雜質(zhì)檢查≤2.15％限量雜質(zhì)檢查GC法（法定方法）GC特點(diǎn)選擇性好靈敏度高速度快分離效能好揮發(fā)性低、不穩(wěn)定、極性強(qiáng)→衍生化易受樣品蒸氣壓限制含量測定載氣→N2固定液→硅酮（OV-17）擔(dān)體→硅藻土或高分子多孔小球柱溫→265℃檢測器→氫火焰離子化檢測器(FID)內(nèi)標(biāo)→正三十二烷

n≥500R≥2內(nèi)標(biāo)法加校正因子色譜條件含量測定內(nèi)標(biāo)法供試液（樣品+內(nèi)標(biāo)）內(nèi)標(biāo)物對(duì)照液（對(duì)照+內(nèi)標(biāo)）是樣品中不存在的物質(zhì)與被測組分峰靠近能與各組分完全分離與被測組分的量接近含量測定HPLC法

外標(biāo)法此外，還有鈰量法、比色法和熒光法含量測定維生素D2(麥角骨化醇)結(jié)構(gòu)維生素D12345678910111213141516171819202122232425262728結(jié)構(gòu)維生素D維生素D3（骨化醇）123456789101112131415161718192021222324252627開環(huán)的甾體：具有甾類化合物的顯色反應(yīng)，可用于鑒別。手性碳原子：具有旋光性，可用于鑒別。多烯：不穩(wěn)定性、紫外吸收。結(jié)構(gòu)與性質(zhì)顯色反應(yīng)醋酐--硫酸反應(yīng)D2

黃紅紫綠

D3

黃紅紫、藍(lán)綠綠三氯化銻反應(yīng)橙紅色漸變粉紅三氯化鐵反應(yīng)橙黃色二氯丙醇和乙酰氯反應(yīng)綠色鑒別試驗(yàn)比旋度鑒別維生素D2維生素D3溶劑

濃度

比旋度值無水乙醇無水乙醇40mg/ml5mg/ml+102.5°～+107.5°+105°～+112°注意事項(xiàng)：應(yīng)于容器開啟30分鐘內(nèi)取樣，在溶液配制后30分鐘內(nèi)測定。鑒別試驗(yàn)如何區(qū)別VitD2

和VitD3鑒別試驗(yàn)96%乙醇溶液乙醇、85%硫酸紅色λmax＝570nm黃色λmax＝495nmVitD2VitD3鑒別試驗(yàn)[鑒別](1)取本品約0.5mg，加三氯甲烷5ml溶解后，加醋酐0.3ml與硫酸0.1ml，振搖，初顯黃色，漸變紅色，迅即變?yōu)樽仙?，最后成綠色。

(2)在含量測定項(xiàng)下記錄的色譜圖中，供試品溶液主峰的保留時(shí)間應(yīng)與對(duì)照品溶液主峰的保留時(shí)間一致。(3)本品的紅外光吸收?qǐng)D譜應(yīng)與對(duì)照的圖譜（光譜集452圖）一致。維生素D2

ChP(2010)鑒別試驗(yàn)[鑒別](1)取本品約0.5mg，加三氯甲烷5ml溶解后，加醋酐0.3ml與硫酸0.1ml，振搖，初顯黃色，漸變紅色，迅即變?yōu)樽仙?、藍(lán)綠色，最后成綠色。

(2)本品的紅外光吸收?qǐng)D譜應(yīng)與對(duì)照的圖譜（光譜集