動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)課件

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心前言

1885年Roux最早嘗試使組織離體培養(yǎng)，材料是雞胚神經(jīng)板，采用生理鹽水為培養(yǎng)液，并首次采用組織培養(yǎng)這個(gè)術(shù)語(yǔ)。1907年Harrison和1912年Carrel開始把組織培養(yǎng)作為一種方法，用于研究離體動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)。由于組織培養(yǎng)在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用，如抗病毒疫苗的生產(chǎn)等，現(xiàn)已經(jīng)逐漸發(fā)展成為一門精細(xì)技術(shù)。許多細(xì)胞株、細(xì)胞系的培育成功，尤其是以人的腫瘤組織為材料建立的各種細(xì)胞系，如Hela細(xì)胞系（Gey，1952），可用來進(jìn)行一系列研究，更加促進(jìn)了組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展。組織培養(yǎng)中熱門的研究領(lǐng)域

1)細(xì)胞內(nèi)部的活動(dòng)，如DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成、能量代謝；2)細(xì)胞內(nèi)部的流動(dòng)，如RNA從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)方向運(yùn)轉(zhuǎn)，激素受體復(fù)合物的易位等；3)生態(tài)學(xué)，如營(yíng)養(yǎng)、感染、病毒或化學(xué)誘變、藥物作用；4)細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用，如胚胎誘導(dǎo)、細(xì)胞群體的動(dòng)力學(xué)等。組織培養(yǎng)的分類及基本概念

分類:1.組織培養(yǎng)(TissueCulture)指的是從體內(nèi)取出組織，在模擬體內(nèi)生理環(huán)境，無(wú)菌、適當(dāng)溫度和一定營(yíng)養(yǎng)條件下，使之生存和生長(zhǎng)并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。2.細(xì)胞培養(yǎng)(CellCulture)培養(yǎng)物是單個(gè)細(xì)胞和細(xì)胞群。3.器官培養(yǎng)（OrganCulture）培養(yǎng)的是器官的原基、器官的一部分或整個(gè)器官，使之在體外生存、生長(zhǎng)和保持一定功能的方法。組織培養(yǎng)的細(xì)胞生物學(xué)特點(diǎn):1.體內(nèi)外細(xì)胞的差異：當(dāng)人工條件和體內(nèi)實(shí)際情況不完全相同時(shí)，細(xì)胞在體外培養(yǎng)后，一旦失去神經(jīng)體液調(diào)節(jié)和細(xì)胞間相互影響，生活在缺乏動(dòng)態(tài)平衡的環(huán)境中，發(fā)生變化則是必然。細(xì)胞最多見的表現(xiàn)是：返祖（Atavism）現(xiàn)象，即失去原有組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)、分化減弱或不顯、細(xì)胞趨單一化、不死性、惡性狀。2.細(xì)胞增殖和分化：是細(xì)胞生命進(jìn)化中所獲得的基本屬性，增殖使細(xì)胞數(shù)量增多；分化使機(jī)體結(jié)構(gòu)和功能多樣化，最后演變成完整的有機(jī)體。培養(yǎng)細(xì)胞的分化

細(xì)胞分化機(jī)制是極其復(fù)雜的，是在細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與體液和細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用下，眾多基因參與、經(jīng)過多階段和多環(huán)節(jié)完成的動(dòng)態(tài)演變過程。不適應(yīng)（Deadaption）

細(xì)胞在體內(nèi)時(shí)所擁有的分化特性減弱或不顯。例如肝細(xì)胞在體外喪失了產(chǎn)生酪氨酸轉(zhuǎn)移酶的特性。脫分化（去分化）（Dedifferentiation）

由于基因變異而使細(xì)胞失去分化能力。如肝細(xì)胞失掉產(chǎn)生精氨酸酶及氨基酸轉(zhuǎn)移酶的特性后，儲(chǔ)存肝糖元的能力喪失，并很難再現(xiàn)。培養(yǎng)細(xì)胞的分化

不適應(yīng)和脫分化兩個(gè)概念不同：不適應(yīng)是因?yàn)樯鏃l件改變而使分化發(fā)生抑制；從分子水平考慮，脫分化很可能是基因變異所致。培養(yǎng)細(xì)胞的分化

培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)

1.貼附型：1）成纖維細(xì)胞：心肌細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞等2）上皮型細(xì)胞：消化管外皮細(xì)胞，肝臟上皮細(xì)胞等3）游走型細(xì)胞：神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞4）多形型細(xì)胞：神經(jīng)組織細(xì)胞2.懸浮型：如癌細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖

1.原代培養(yǎng)（PrimaryCulture）階段：或稱初代培養(yǎng)。從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代，隨不同的組織時(shí)間長(zhǎng)短不一，一般為1~4w2.傳代培養(yǎng)（Subculture）階段：或稱繼代培養(yǎng)。也就是細(xì)胞系（Cellline）階段，細(xì)胞增殖旺盛，一般細(xì)胞可傳代10-50代）。3.衰退階段：自發(fā)性轉(zhuǎn)化（SpontaneousTransformation）：其標(biāo)志是獲得永生性（Immortality）或惡性性（Malignancy）:細(xì)胞獲持久性增殖能力，這樣的細(xì)胞群體稱無(wú)限細(xì)胞系(Infinitecellline)或連續(xù)細(xì)胞系(Continuouscellline)。如：BHK（倉(cāng)鼠腎成纖維細(xì)胞），F(xiàn)9（小鼠胚胎癌細(xì)胞），M2R（黑色素瘤細(xì)胞）等。培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖

培養(yǎng)細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到一定密度后，都需要做傳代處理，傳代的頻率或間隔與培養(yǎng)液的性質(zhì)、接種細(xì)胞的數(shù)量和細(xì)胞增殖速度有關(guān)。所謂細(xì)胞“一代”，即從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)的一段時(shí)間。如某一細(xì)胞系為50代即該細(xì)胞已傳代50次。

細(xì)胞傳代的三個(gè)階段

1）潛伏期（Latentphase）：細(xì)胞從接種到貼壁生長(zhǎng)繁殖的一段時(shí)間。二倍體細(xì)胞該期時(shí)間長(zhǎng)（24~96h）；連續(xù)細(xì)胞系時(shí)間短（10~30min）。

2)指數(shù)生長(zhǎng)期（Logarthmicgrowthphase）：細(xì)胞增殖最旺盛時(shí)期，一般用細(xì)胞分裂指數(shù)（Mitoticindex，MI）表示，即細(xì)胞群中每1000個(gè)細(xì)胞中的分裂相數(shù)。體外培養(yǎng)細(xì)胞分裂指數(shù)介于0.1~0.5%，且受細(xì)胞種類培養(yǎng)液成分、pH、溫度等影響。細(xì)胞傳代的三個(gè)階段

指數(shù)生長(zhǎng)期是細(xì)胞活力最好的時(shí)期，在接種細(xì)胞數(shù)量適宜情況下，指數(shù)生長(zhǎng)期持續(xù)3-5d后，隨細(xì)胞數(shù)量不斷增多，生長(zhǎng)空間日趨減少，細(xì)胞相互接觸匯合成片，呈現(xiàn)接觸抑制（Contactinhibition）。而惡性細(xì)胞則無(wú)接觸抑制現(xiàn)象，因此接觸抑制可作為區(qū)分正常與癌細(xì)胞標(biāo)志之一。癌細(xì)胞則由于營(yíng)養(yǎng)成分的消耗和細(xì)胞代謝產(chǎn)物的影響而發(fā)生密度抑制（Densityinhibition）3)停滯期（Stagnatephase）：即細(xì)胞數(shù)量達(dá)到飽和密度后，細(xì)胞與營(yíng)養(yǎng)液的交換面積減少，代謝產(chǎn)物積累，PH下降細(xì)胞停止增殖，進(jìn)入停滯期。在此時(shí)應(yīng)及時(shí)進(jìn)行換液傳代，否則因細(xì)胞中毒受損，大量細(xì)胞出現(xiàn)死亡，至少再傳1-2代后，細(xì)胞才能恢復(fù)。細(xì)胞傳代的三個(gè)階段

細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件

1)儀器和設(shè)備:常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備：如CO2孵箱；培養(yǎng)器材：如培養(yǎng)瓶，純水設(shè)備，干燥消毒除菌設(shè)備，清洗設(shè)備等。2)培養(yǎng)液:目前常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)液均已商品化，如RPMI1640，MEM，DMEM，F(xiàn)12等，可根據(jù)培養(yǎng)需求合理選擇。細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件

3)血清：一般常用為小牛血清(包括胎牛血清)，人血清和其它動(dòng)物血清。由于不同的研究目的，血清成分往往干擾研究實(shí)驗(yàn)，如進(jìn)行藥物和受體及營(yíng)養(yǎng)等方面的研究時(shí)，需要使用無(wú)血清培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件4)平衡鹽溶液:主要用于作為稀釋和灌注的液體，維持細(xì)胞滲透壓，提供緩沖系統(tǒng)，使培養(yǎng)液的酸監(jiān)度維持在培養(yǎng)細(xì)胞生理范圍內(nèi)，提供細(xì)胞正常代謝所需的水分和無(wú)機(jī)離子等。常用的有PBS，Hank’s等。5)抗生素:常用為青霉素（每毫升培養(yǎng)液50~100單位）和鏈霉素（每毫升培養(yǎng)液50~100微克）。6)其它添加成分：緩沖系統(tǒng)，常用為HEPES（N’-2-hydroxy-ethylpiperazine-N’-ethanesulfonicacid），緩沖效能(pKa)在20℃時(shí)為7.55，37℃為7.31；HEPES不是起維持pH恒定的作用，而是起恒定和抵抗快速pH變化的，所以調(diào)整pH常常用NaHCO3溶液。有機(jī)補(bǔ)充物，如丙酮酸鈉，谷胺酰氨等。促細(xì)胞分裂因子，如生長(zhǎng)因子類的FGF(成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)，EGF(表皮生長(zhǎng)因子)。貼壁和鋪展因子，如膠原蛋白，纖粘蛋白等。可根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞的特殊要求進(jìn)行添加。細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件培養(yǎng)液的物理性質(zhì)

pH值：大多數(shù)細(xì)胞在pH7.4時(shí)生長(zhǎng)最好，一般不低于6.8，不高于7.6。酚紅是常用的指示劑，用來檢測(cè)PH的變化：紅色--pH7.4，橙色--pH7.0，黃色--pH6.5，藍(lán)紅色--pH7.6，紫色--pH7.8。溫度：溫度除直接影響細(xì)胞生長(zhǎng)外，還與培養(yǎng)液的pH值有關(guān)，溫度低時(shí)CO2溶解性增加，從而影響pH。滲透壓：培養(yǎng)液滲透壓一般介于260~320mosm/kg之間。人類血漿滲透壓290mosm/kg，小鼠類為310mosm/kg。粘度：由于血清的存在，直接影響培養(yǎng)液粘度。表面張力：培養(yǎng)液的表面張力有利于培養(yǎng)物粘著于底物上面。培養(yǎng)液的物理性質(zhì)

細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法

1.組織、細(xì)胞的解離方法1.1解離組織：在無(wú)菌情況下采取動(dòng)物的組織或器官，放在含有抗生素的平衡鹽溶液(BSS)中，然后盡快在超凈臺(tái)或無(wú)菌室內(nèi)進(jìn)行解離處理。解離時(shí)應(yīng)注意:1)盡可能將脂肪和壞死組織去除干凈；2)剪碎組織時(shí)，避免損傷組織塊；3)解離組織用的各種酶系，需要先進(jìn)行低速離心。解離細(xì)胞常用酶和鰲合劑進(jìn)行解離：當(dāng)實(shí)驗(yàn)室需要制備具有均勻細(xì)胞層的培養(yǎng)物；從單個(gè)細(xì)胞出發(fā)獲得細(xì)胞群體；從一定量的組織中獲得最多的細(xì)胞量時(shí)。解離細(xì)胞的方法1）胰蛋白酶解離細(xì)胞法：所需時(shí)間較短，主要缺點(diǎn)是破損細(xì)胞。2）膠原酶解離細(xì)胞法：這種方法對(duì)解離胚胎性、正常和惡性組織是很有效的。膠原酶最終濃度200u/ml，36.5℃溫育，一般溫育4-48h。膠原酶和透明質(zhì)酸酶協(xié)同作用有助于分離大鼠或兔的肝臟組織。3）機(jī)械解離細(xì)胞法：比酶法所需時(shí)間短，但細(xì)胞存活率較低。4）螯合劑解離細(xì)胞法：分離效果差原代細(xì)胞培養(yǎng)

1）外植塊培養(yǎng)：外植塊在一定限度內(nèi)可保持其原有組織結(jié)構(gòu)，有利于其適應(yīng)體外培養(yǎng)環(huán)境。短期培養(yǎng)的外植塊成為細(xì)胞培養(yǎng)的材料來源之一。2）單層細(xì)胞培養(yǎng)：每隔1~3d換液一次，細(xì)胞長(zhǎng)成單層后傳代培養(yǎng)。3）懸浮細(xì)胞培養(yǎng)：使細(xì)胞成懸浮狀態(tài)在培養(yǎng)液中連續(xù)生長(zhǎng)。由于細(xì)胞本身是不粘附的，如小鼠白血病細(xì)胞和腹水腫瘤細(xì)胞；通過機(jī)械攪動(dòng)使細(xì)胞保持懸浮狀態(tài)；通過選擇培養(yǎng)得到能懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。原代細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)注意的幾個(gè)問題

1）培養(yǎng)液和培養(yǎng)物的比例：一定濃度的培養(yǎng)液僅能支持一定數(shù)量的細(xì)胞生長(zhǎng)，不能盲目增加每單位體積的細(xì)胞濃度。2）PH：初培養(yǎng)pH應(yīng)為7.4，培養(yǎng)過程應(yīng)不低于7.0。3）培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的空間：一般培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液與液面上的空間體積之比為1:10。

4）容積、深度、表面面積：培養(yǎng)液體積與表面面積的比例為0.2~0.5ml/cm2。需高濃度氧的，在淺的培養(yǎng)液（2mm）中生長(zhǎng)較好；需要低濃度氧的。在深的培養(yǎng)液（5mm）中生長(zhǎng)較好。5）去除死細(xì)胞6）溫度控制：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)溫度波動(dòng)的敏感性很大。溫度低于36.5℃，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢；溫度高于37.5℃，細(xì)胞存活力降低。細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)注意的