第七章 干細(xì)胞

第七章干細(xì)胞第一節(jié)干細(xì)胞概述第二節(jié)胚胎干細(xì)胞的研究第三節(jié)成體干細(xì)胞的研究第四節(jié)在再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用第一節(jié)干細(xì)胞概述

一、干細(xì)胞（stemcell）的概念二、干細(xì)胞的特征三、干細(xì)胞的分類四、干細(xì)胞分化發(fā)育的途徑

五、細(xì)胞因子

一、干細(xì)胞概念

具有自我更新、高度增殖能力的細(xì)胞，能產(chǎn)生表現(xiàn)型和基因型和自己完全相同的子細(xì)胞，同時還能分化為祖細(xì)胞。即這些細(xì)胞可以通過細(xì)胞分裂維持細(xì)胞群的大小，同時又可以進(jìn)一步分化成各種不同的組織細(xì)胞，從而構(gòu)成有機體各種復(fù)雜的組織和器官。

二、干細(xì)胞的一般特性發(fā)育的全能性或多能性無限的自我更新能力長的生命周期及相對慢的增殖速度極強的再生能力易操作性

1、發(fā)育的全能性或多能性

ES細(xì)胞具有發(fā)育全能性，適當(dāng)條件下，在體外長期培養(yǎng)或凍存，也不影響。小鼠ES在實驗室已培養(yǎng)10多年。人類ES細(xì)胞在體外已傳代250代。組織干細(xì)胞以前一直以為只能分化出來源組織的細(xì)胞類型，目前的研究已發(fā)現(xiàn)可分化成來源以外組織的細(xì)胞。如骨髓間質(zhì)干細(xì)胞，可分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、血細(xì)胞、肝細(xì)胞、肌細(xì)胞等。但多數(shù)組織干細(xì)胞是單能性的，如生精干細(xì)胞。2、無限的自我更新能力

成體組織的干細(xì)胞群相對穩(wěn)定，干細(xì)胞通過不對稱分裂方式在完成組織細(xì)胞更新補充的同時，也使干細(xì)胞池保持穩(wěn)定。如果在干細(xì)胞水平出現(xiàn)DNA復(fù)制錯誤，這些變異的遺傳信息將隨著不對稱分裂而擴大到整個干細(xì)胞群，導(dǎo)致異常分化和細(xì)胞功能紊亂。3、長的生命周期及相對慢的

增殖速度

不同組織干細(xì)胞自我更新速度不同，如小腸和造血系統(tǒng)的上皮細(xì)胞更新速度較快，約12小時。但肝干細(xì)胞只在受損傷較重的情況下，才激活和分裂。神經(jīng)干細(xì)胞長期存在在神經(jīng)組織中，不知道它的功能是什么。在機體穩(wěn)定狀態(tài)下，組織細(xì)胞數(shù)量的保持和補充主要是定向祖細(xì)胞。干細(xì)胞只是在必要時分裂補充定向祖細(xì)胞。相對祖細(xì)胞，干細(xì)胞分裂速度慢。4、極強的再生能力

多數(shù)干細(xì)胞都有參與組織再生和修復(fù)的能力。個別干細(xì)胞如神經(jīng)干細(xì)胞在體外誘導(dǎo)實驗中具有分化潛力，但在體內(nèi)，就沒有這個能力，認(rèn)為缺乏干細(xì)胞分化的環(huán)境和條件，所以中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后不能修復(fù)。

5、易操作性干細(xì)胞容易在體外培養(yǎng)，為各種遺傳操作創(chuàng)造了條件。如基因轉(zhuǎn)移、基因打靶等都不影響干細(xì)胞的發(fā)育潛力。如利用ES細(xì)胞做為外源基因的載體。三、干細(xì)胞的分類

以細(xì)胞分化能力來分：1、單能干細(xì)胞2、多能干細(xì)胞3、全能干細(xì)胞以細(xì)胞來源分：1、胚胎干細(xì)胞（ES、EG）2、組織干細(xì)胞（成體干細(xì)胞）1、單能干細(xì)胞只能向一種細(xì)胞分化或密切相關(guān)的兩類細(xì)胞分化。如皮膚上皮干細(xì)胞。這個概念以后是否能存在？2、多能干細(xì)胞（pluripotentstemcell）

具有分化出多種組織細(xì)胞的潛能，但不能形成完整有機體。如小腸干細(xì)胞可分化為上皮細(xì)胞、腺細(xì)胞等。骨髓造血干細(xì)胞可形成12種細(xì)胞。3、全能干細(xì)胞（totipotentstemcell）能分化成各種細(xì)胞，形成一個完整的有機體潛能。如受精卵和胚胎干細(xì)胞。

四、

干細(xì)胞分化發(fā)育的途徑

干細(xì)胞——定向祖細(xì)胞——分化細(xì)胞干細(xì)胞具有無限的自我更新能力，但分裂不頻繁，數(shù)量保持穩(wěn)定。定向祖細(xì)胞增殖能力有限，有一定的分化潛力，是干細(xì)胞最終形成某種分化細(xì)胞的祖先細(xì)胞（progenitorcell）。分化細(xì)胞的分化標(biāo)記基因全部表達(dá)，沒有繼續(xù)分裂能力，壽命較短。也有例外如神經(jīng)細(xì)胞壽命長。

干細(xì)胞祖細(xì)胞分化細(xì)胞是否表達(dá)分化標(biāo)記蛋白沒有開始具備有增殖能力無限有無自我更新能力無限無無產(chǎn)生分化后代的能力有有限無參與受損組織的再生能力長期有暫時有無

五、干細(xì)胞不對稱分裂

不對稱分裂：干細(xì)胞分裂產(chǎn)生2個細(xì)胞，1個為干細(xì)胞，另一個為祖細(xì)胞，然后由祖細(xì)胞產(chǎn)生分化細(xì)胞。如多數(shù)無脊椎動物。對稱分裂（群體不對稱分裂）：從單個干細(xì)胞看，干細(xì)胞分裂產(chǎn)生2個細(xì)胞，或者都是干細(xì)胞，或者都為祖細(xì)胞，為對稱分裂。但從干細(xì)胞群體看，平均每個干細(xì)胞仍為不對稱分裂，如哺乳動物。六、細(xì)胞因子與干細(xì)胞微環(huán)境

細(xì)胞因子在傳遞細(xì)胞與胞外基質(zhì)間、細(xì)胞與細(xì)胞間的信息中起重要作用。細(xì)胞因子有干細(xì)胞因子（SCF）、白細(xì)胞介素(ILs)、干細(xì)胞生長因子(CSF)、表皮細(xì)胞生長因子(EGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)等。1999年Goodell分離出小鼠肌干細(xì)胞，體外培養(yǎng)5天后，與少量的骨髓間質(zhì)細(xì)胞一起移植入小鼠中，結(jié)果肌干細(xì)胞分化為各種血細(xì)胞。這個現(xiàn)象稱為干細(xì)胞橫向分化，認(rèn)為是周圍環(huán)境影響的結(jié)果。干細(xì)胞微環(huán)境（干細(xì)胞壁戶，Niche）對細(xì)胞分化起很重要的調(diào)控作用

第二節(jié)

胚胎干細(xì)胞的研究一、胚胎干細(xì)胞的概念二、胚胎干細(xì)胞的研究歷史三、胚胎干細(xì)胞的分離培養(yǎng)、建系技術(shù)四、定向誘導(dǎo)分化五、胚胎干細(xì)胞系基本特征一、胚胎干細(xì)胞的概念從早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（innercellmass,ICM）（大約140個細(xì)胞）分離來的（ES細(xì)胞）或從生殖嵴分離的原生殖細(xì)胞（EG細(xì)胞），經(jīng)體外抑制分化培養(yǎng)，所獲得的具有保持未分化狀態(tài)的無限增殖能力的細(xì)胞，這些細(xì)胞在適宜的條件下，能夠分化成各種類型的細(xì)胞、組織。二、胚胎干細(xì)胞的研究歷史

20世紀(jì)80年代初，英國劍橋大學(xué)Evans和Kaufman以及美國Martin實驗室獨立從小鼠囊胚分離可在體外培養(yǎng)的正常干細(xì)胞，名為EK細(xì)胞。開創(chuàng)了ES細(xì)胞生物學(xué)研究的新時代。在此后胚胎干細(xì)胞在其他動物的分離和建系卻受挫折，到80年代后期才有所突破。20世紀(jì)90年代美國Matsui等從小鼠9天的胚胎生殖嵴建立了生殖細(xì)胞系，稱EG細(xì)胞系，以后其他動物也相繼建立ES和EG細(xì)胞系。1998年美國威斯康星大學(xué)的Thomson等利用36枚新鮮或凍存的人工體外受精的胚胎，獲得人的ICM細(xì)胞，建立了5株ES細(xì)胞系，以后從流產(chǎn)的胎兒培養(yǎng)出EG細(xì)胞系。這兩個細(xì)胞系的建立和應(yīng)用可能涉及社會和倫理問題，應(yīng)當(dāng)引起重視。1981-2000年，建立豬、牛、兔、綿羊、山羊、魚、倉鼠、恒訶、河猴、人ES細(xì)胞系。三、胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)、建系技術(shù)

1、抑制分化培養(yǎng)2、ES細(xì)胞的分離培養(yǎng)3、EG細(xì)胞的分離培養(yǎng)1、抑制分化培養(yǎng)由于早期細(xì)胞離體后極易發(fā)生分化，所以首先阻止其分化，確保全能性是關(guān)鍵。細(xì)胞分化抑制物是飼養(yǎng)層細(xì)胞、條件培養(yǎng)基和分化抑制因子，抑制分化培養(yǎng)方法有2種。1）飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)法2）無飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)法飼養(yǎng)層培養(yǎng)法分離的細(xì)胞生長在小鼠飼養(yǎng)層上（一種用射線照射或者加入有絲分裂抑制劑如用絲裂霉素處理的成纖維細(xì)胞層，成纖維細(xì)胞不能分裂，但能分泌LIF）。

操作比較麻煩，但成功率高，是早期培養(yǎng)的首選方法。無飼養(yǎng)層培養(yǎng)法在培養(yǎng)基中加入白血病抑制因子（LIF）、白介素6或條件培養(yǎng)基如2-3周齡幼年大鼠心肌細(xì)胞條件培養(yǎng)液。2、ES細(xì)胞的分離培養(yǎng)基本培養(yǎng)液：15%-20%小牛血清、0.1mmol/l旈基乙醇和雙抗的DMEM液。將囊胚接種到鋪有飼養(yǎng)層的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)2-3天分離ICM細(xì)胞。

免疫手術(shù)法常規(guī)培養(yǎng)法3、EG細(xì)胞的分離培養(yǎng)

在解剖鏡下取生殖嵴，接種到飼養(yǎng)層細(xì)胞上，細(xì)胞分裂增殖，消化后再培養(yǎng)。

四、定向誘導(dǎo)分化細(xì)胞誘導(dǎo)分化是細(xì)胞與其微環(huán)境相互間復(fù)雜而精密協(xié)調(diào)的分子細(xì)胞學(xué)過程。60年代已知誘導(dǎo)現(xiàn)象。譜系分化：經(jīng)過譜系祖細(xì)胞、譜系定型細(xì)胞和終末分化細(xì)胞的分化全過程。會出現(xiàn)不穩(wěn)定的過渡細(xì)胞。用于基礎(chǔ)研究。定向分化：控制ES細(xì)胞定向產(chǎn)生單一類型的終末分化細(xì)胞。用于細(xì)胞移植和治療。定向誘導(dǎo)的體細(xì)胞有：造血細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、胰島細(xì)胞、生殖細(xì)胞。

四、定向誘導(dǎo)分化誘導(dǎo)物有兩類：1、誘導(dǎo)細(xì)胞可逆性的輕度損傷。如無機物、有機酸、醇、氨水或缺鈣的鹽水等。滲透壓改變，造成神經(jīng)細(xì)胞分化。2、與被誘導(dǎo)的細(xì)胞表面受體結(jié)合而介導(dǎo)的細(xì)胞分化。類固醇激素、多肽生長因子。誘導(dǎo)物濃度、時間、作用模式可導(dǎo)致不同分化，非常復(fù)雜，定向誘導(dǎo)是胚胎干細(xì)胞研究的熱門話題。

五、胚胎干細(xì)胞系基本特性體外無限增殖體外產(chǎn)生分化細(xì)胞體內(nèi)產(chǎn)生畸胎瘤巢狀生長，有多能干細(xì)胞分子標(biāo)記染色體數(shù)目和核型正常遺傳可操作性形成嵌合體實現(xiàn)種系傳遞第四節(jié)組織干細(xì)胞（成體干細(xì)胞）

一、組織干細(xì)胞概述二、表皮干細(xì)胞（ESCs）三、骨髓干細(xì)胞四、神經(jīng)干細(xì)胞五、成肌細(xì)胞

六、肝干細(xì)胞七、成體干細(xì)胞研究中存在的問題3一、組織干細(xì)胞概述1、概念2、對組織干細(xì)胞的認(rèn)識1、概念

一群分布在成體組織中未分化的具有自我更新潛能的并負(fù)有構(gòu)建和補充某種組織的各種類型的細(xì)胞的干細(xì)胞。對成體干細(xì)胞的認(rèn)識傳統(tǒng)觀念：人體除血液、皮膚、消化管和肝有再生能力，其他組織沒有再生能力；成體干細(xì)胞是專能的，只屬于某種組織，即造血干細(xì)胞只能形成血細(xì)胞。最新研究：成體干細(xì)胞的發(fā)育潛能可跨越組織和胚層界限如小鼠神經(jīng)干細(xì)胞移植到經(jīng)射線照射的骨髓，分化出血液細(xì)胞。此后發(fā)現(xiàn)可分化為肌細(xì)胞。表明微環(huán)境的改變，造成分化潛能的改變。二、表皮干細(xì)胞ESCsESCs的概念ESCs的生物學(xué)特征ESCs的鑒別與分離方法

ESCs的概念

存在于表皮內(nèi)，一生均保持有增殖能力，可增殖分化為表皮中各種類型的細(xì)胞。從再生能力角度：表皮中有表皮干細(xì)胞、短暫增殖細(xì)胞或祖細(xì)胞(transitamplifying，TA)、有絲分裂后(post-mitoticdifferentiating，PMD)細(xì)胞。

ESCs的生物學(xué)特征

自我更新增殖能力慢周期性對基底膜的黏附作用形態(tài)學(xué)特點定位

在體內(nèi)表現(xiàn)為可增殖分化形成表皮的全層并維持自身的數(shù)量，在體外則表現(xiàn)為克隆性生長。自我更新增殖能力

慢周期體內(nèi)表現(xiàn)為標(biāo)記滯留細(xì)胞（label-retainingcell,LRC）。在新生動物細(xì)胞分裂活躍時摻入氚標(biāo)記的胸苷，細(xì)胞在DNA合成的過程中攝取標(biāo)記的核苷酸而將標(biāo)記整合到

DNA中，由于干細(xì)胞分裂緩慢，這樣的標(biāo)記可以維持相當(dāng)長的一段時間，因而可長期探測到放射性活性，如小鼠表皮干細(xì)胞的滯留標(biāo)記可長達(dá)兩年。

對基底膜的黏附作用

干細(xì)胞主要通過表達(dá)整合素實現(xiàn)對基底膜各種成分的粘附。各種整合素作為受體分子與基底膜各種成分相應(yīng)的配體結(jié)合，如與層黏連蛋白結(jié)合的有整合素α1β1、α2β1、α3β1、α6β4，與纖連蛋白結(jié)合的有整合素α3β1，與膠原結(jié)合的有整合素α2β1。干細(xì)胞與基