第九講 頭孢菌素類

頭孢菌素CCephalosporinC

頭孢菌素C1頭孢菌素C概述2頭孢菌素C的生物合成3菌種選育與保存4發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化5頭孢菌素C的分離純化工藝67-ACA的酶法制備與直接發(fā)酵生產(chǎn)1頭孢菌素C概述頭孢菌素C是由Newton和Abraham于1953年繼青霉素之后，在自然界中發(fā)現(xiàn)的第二種類型的β-內(nèi)酰胺類抗生素。頭孢菌素C與青霉素有許多共同特征，抗菌作用機(jī)制也是抑制細(xì)菌細(xì)胞壁肽的合成，對(duì)人體安全無(wú)毒。頭孢菌素C的化學(xué)結(jié)構(gòu)1961年證實(shí)了頭孢菌素C的化學(xué)結(jié)構(gòu)1237頭孢菌素C概述(2)頭孢菌素C抗菌活性低，受半合成青霉素啟示，通過(guò)結(jié)構(gòu)改造獲得了很多更有效的半合成頭孢菌素，因此頭孢菌素C是目前各種半合成頭孢菌素的起始原料之一。在溫和的條件下，用酸水解頭孢菌素C可得除去側(cè)鏈的母核，即7-氨基頭孢霉烷酸（7-ACA）。頭孢菌素C概述(3)經(jīng)酸水解或乙酰酯酶處理頭孢菌素C，則生成去乙酰頭孢菌素C（簡(jiǎn)稱DCPC，3位-CH2OH）。用鈀碳及氫使頭孢菌素C氫化可得到去乙酰氧頭孢菌素C（DOCPC或7-ADCA，3位-CH3）。2頭孢菌素C生物合成前體氨基酸的生物合成頭孢菌素C的生物合成頭孢菌素C的結(jié)構(gòu)α-氨基已二酸半胱氨酸纈氨酸醋酸（側(cè)鏈）7－氨基頭孢烷酸（7－ACA）（母核）α-氨基己二酸前體氨基酸的生物合成α-氨基己二酸（α-AAA）的生物合成（葡萄糖、氨水）纈氨酸（Val）的生物合成（葡萄糖、氨水）半胱氨酸（Gys）的生物合成（葡萄糖、氨水、SO42－）ACV三肽IPN：異青霉素N擴(kuò)環(huán)酶羥化轉(zhuǎn)乙?；揭阴?S-CoA轉(zhuǎn)?；磻?yīng)脫乙酰氧頭孢菌素C合成酶頭孢菌素C的生物合成(1)頭孢菌素C也是由α-氨基己二酸(α-AAA),半胱氨酸和纈氨酸經(jīng)三肽途徑生物合成ACV三肽，而且在異青霉素N以前的階段和青霉素的生物合成完全一樣。此后，經(jīng)頂頭孢霉產(chǎn)生的異構(gòu)酶作用，將異青N（IPN）轉(zhuǎn)化為青霉素N，再由擴(kuò)環(huán)酶（脫乙酰氧頭孢菌素C合成酶）催化擴(kuò)環(huán)生成脫乙酰氧頭孢菌素C，最后通過(guò)羥化和轉(zhuǎn)乙?；磻?yīng)得到頭孢菌素C。3菌種選育與保存(1)原始親株：頂頭孢霉M8650，全世界所有高產(chǎn)菌差不多都是由它反復(fù)誘變、篩選得到的。出發(fā)菌株通過(guò)誘變?cè)谕耆囵B(yǎng)基上獲得蛋氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷株，然后轉(zhuǎn)入加有各種含硫化合物（如硫酸鹽）以代替Met的基本培養(yǎng)基，可篩選出不需要加入Met的高產(chǎn)突變株，從而降低成本。菌種選育與保存(2)原生質(zhì)體融合也是高產(chǎn)菌株選育的一種有效方法。頂頭孢霉的細(xì)胞壁對(duì)β-葡萄糖苷酸酶敏感，可用Helixpomatia產(chǎn)生的這種酶進(jìn)行破壁，形成原生質(zhì)體。聚乙烯醇能促進(jìn)原生質(zhì)體的融合和重組細(xì)胞的再生。菌種選育與保存(3)由于擴(kuò)環(huán)和羥化是頭孢菌素C生物合成途徑限速階段，因此可用現(xiàn)代基因工程技術(shù)構(gòu)建含克隆的擴(kuò)環(huán)/羥化酶基因的質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)入工業(yè)生產(chǎn)菌株中，獲得顯著提高頭孢菌素C生產(chǎn)能力的基因工程菌。菌種選育與保存(4)菌株的保存可以采用冷凍干燥法或液氮法。由于保存的大部分是營(yíng)養(yǎng)菌絲，長(zhǎng)期保存后生命力的恢復(fù)較差，故經(jīng)過(guò)保存的菌株應(yīng)對(duì)存活細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并在搖瓶及中試條件下開(kāi)展能力試驗(yàn)，挑選復(fù)壯的菌落作為生產(chǎn)用種子。4發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化培養(yǎng)基通氣攪拌菌絲生長(zhǎng)速率菌絲形態(tài)發(fā)酵終點(diǎn)培養(yǎng)基(1)氮源玉米漿已經(jīng)被證明是一種優(yōu)良的氮源，它提供各種豐富的氨基酸、肽、蛋白質(zhì)和微量元素，起始用量一般為2~6g/L；其它氮源有花生餅粉、硫酸銨、氨、尿素等。當(dāng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的氮源消耗到一定濃度時(shí)，要不斷補(bǔ)加氮源（硫酸銨或氨），以維持發(fā)酵液中氨氮含量在0.5~0.7g/L之間。補(bǔ)氨還能起到控制pH的作用。培養(yǎng)基(2)碳源可使用葡萄糖、糊精、淀粉或植物油。植物油通常作為流加碳源，而其它碳源加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。添加無(wú)機(jī)鹽以滿足菌絲生長(zhǎng)對(duì)Mg2+、PO43-等的需要，特別是當(dāng)采用含有有機(jī)物少的稀薄培養(yǎng)基時(shí)。通氣攪拌(1)在頭孢菌素C發(fā)酵中要求較高的氧傳遞速率，以維持所需的溶氧濃度。因?yàn)槿牡沫h(huán)化、青霉素N的擴(kuò)環(huán)和脫乙酰氧頭孢菌素C的羥化都是氧化反應(yīng)。為了維持所需的溶氧濃度，一般攪拌輸入功率為4kW/m3(發(fā)酵液)以上。通氣攪拌(2)根據(jù)溶氧的變化情況，可將發(fā)酵過(guò)程分為兩個(gè)階段。第一階段是菌絲量高速增長(zhǎng)、溶氧迅速下降的生長(zhǎng)階段。這一階段必須在溶氧成為限制因子之前結(jié)束，它可以通過(guò)使碳源成為限制因子來(lái)達(dá)到。通氣攪拌(3)在生產(chǎn)的第二階段，要嚴(yán)格控制油的流加量，使溶氧始終保持在25％飽和度以上。一旦加油過(guò)多，可以提高攪拌轉(zhuǎn)速和發(fā)酵溫度。以加速氧的傳遞和油的消耗，避免溶氧過(guò)分下降。菌絲生長(zhǎng)速率實(shí)驗(yàn)表明，用豆油作為生長(zhǎng)限制基質(zhì)時(shí)，比生長(zhǎng)率則與比生產(chǎn)率成正比；比生長(zhǎng)率由0.01/h提高到0.04/h，比生產(chǎn)率增加到2倍。因此用葡萄糖碳源可調(diào)控菌絲生長(zhǎng)率。菌絲形態(tài)在頭孢菌素C發(fā)酵過(guò)程中，產(chǎn)生菌頂頭孢霉呈現(xiàn)明顯的形態(tài)。在快速生長(zhǎng)期，菌體以細(xì)長(zhǎng)到絲狀為主；隨著營(yíng)養(yǎng)的消耗和比生長(zhǎng)率的下降，菌絲開(kāi)始膨脹、斷裂，最后形成單細(xì)胞的節(jié)孢子。發(fā)酵終點(diǎn)（1）頭孢菌素C是不穩(wěn)定的化合物，其發(fā)酵終點(diǎn)由產(chǎn)率、產(chǎn)物組成、成本、效益、過(guò)濾速度等綜合因素來(lái)決定。發(fā)酵終點(diǎn)（2）頭孢菌素C在發(fā)酵過(guò)程中，一方面分子中的β-內(nèi)酰胺以5×10-3/h的一級(jí)反應(yīng)速率非酶降解，故隨著發(fā)酵液中頭孢菌素C濃度的提高，絕對(duì)降解量逐漸加大。發(fā)酵終點(diǎn)（3）另一方面，由于乙酰酯酶的存在，部分頭孢菌素C被轉(zhuǎn)化為脫乙酰頭孢菌素C，而且它比較穩(wěn)定，因而占發(fā)酵總產(chǎn)物的比例將越來(lái)越高。β-內(nèi)酰胺環(huán)降解后的產(chǎn)物及脫乙酰頭孢菌素C含量的增加，將對(duì)頭孢菌素C的回收造成不利的影響。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，由于菌絲形態(tài)的變化及