分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)4h

分子診斷學(xué)

羅建新第一章序論

第一節(jié)概述分子診斷學(xué)的形成在分子生物學(xué)及生物化學(xué)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，以研究核酸和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能等生命本質(zhì)的學(xué)科，在核酸、蛋白質(zhì)分子水平研究疾病的發(fā)病、診斷、治療和預(yù)后的機(jī)制。其中基因工程是目前分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，這些技術(shù)可以改造或擴(kuò)增基因和基因產(chǎn)物，使微量的研究對象達(dá)到分析水平，是研究基因表達(dá)和調(diào)控的方法，也是在分子水平研究疾病發(fā)生機(jī)制、基因診斷和基因治療的方法。

主要內(nèi)容1.內(nèi)源基因異常的檢驗(yàn)和診斷自身基因結(jié)構(gòu)異常基因功能異常表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能異常致病基因調(diào)控異常致病如腫瘤遺傳病2.外源基因侵入體內(nèi)檢測及診斷病原微生物B,V依核心部分基因DNA,RNA不同檢測及病原學(xué)分類如HBVHIV等核酸是生命的存在形式蛋白質(zhì)是生命表現(xiàn)形式3.分子診斷學(xué)與以往醫(yī)學(xué)診斷的關(guān)系DNARNA臨床表現(xiàn)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄翻譯基因診斷生化檢驗(yàn)臨床診斷HGP完成第二節(jié)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)

一、基本概念核酸（ＤＮＡＲＮＡ）結(jié)構(gòu)理化性質(zhì)復(fù)性變性Tm值蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)理化性質(zhì)

基因重組(Geneticrecombination)基因重組是自然界常見到現(xiàn)象，指的是整段DNA在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間、甚至在不同物種之間進(jìn)行交換，并能在新的位置上復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯。它在進(jìn)化、繁殖、病毒感染、基因表達(dá)以及癌基因激活等過程中起著重要作用。也可以認(rèn)為是一種自然突變現(xiàn)象。

基因重組的方式轉(zhuǎn)化(Transformation)

外來基因引起細(xì)胞生物性狀改變的過程或?qū)①|(zhì)粒或以質(zhì)粒為載體的重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程。

轉(zhuǎn)染（Transfection）

以噬菌體或病毒或以之為載體所構(gòu)建的重組DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞的過程。

轉(zhuǎn)導(dǎo)（Transduction）

利用載體把遺傳物質(zhì)從一種宿主傳給另一宿主的過程。轉(zhuǎn)位（Transposition）

一個或一組基因從一處轉(zhuǎn)移到基因組的另一位置的過程，這些游動的基因稱為轉(zhuǎn)位子(Transposon)。

遺傳工程廣義:整體水平細(xì)胞水平染色體水平分子水平狹義:指分子水平基因工程基因克隆DNA克隆重組DNA技術(shù)相關(guān)概念

DNA克隆

克?。╟lone）：

來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。

克隆化（cloning）：

獲取同一拷貝的過程，即無性繁殖。 分子克?。―NA克?。? 細(xì)胞克隆 個體克隆（動物或植物）基因工程（Geneengineering）

定義

指在體外將外源核酸分子插入質(zhì)粒、病毒或其它載體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，并使之參入到原先沒有這類分子的寄主細(xì)胞內(nèi)，并且能持續(xù)穩(wěn)定地繁殖。基因克?。℅enecloning）體外重組DNA技術(shù)（invitrorecombinantDNAtechnology）DNA克隆：應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來源的

DNA與載體DNA結(jié)合成具有自我復(fù)制能力的

DNA分子，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增、提取獲得大量同一DNA分子。又稱基因克隆或重組DNA。1972年P(guān).Bergetc首次用EcoRI切.接

SV40和λphageDNA構(gòu)建第一個人工DNA分子.獲1981年諾貝爾化學(xué)獎1973年Cohens.etc用EcoRI切.體外連接質(zhì)粒Tc-pSC101和Neo-R6-5導(dǎo)入大腸桿菌,使其具有四環(huán)素和新酶素抗性.完成第一分子克隆全過程.

重組DNA技術(shù)基本原理

分離純化或人工合成帶有目的基因的DNA片段；在體外將目的基因與載體DNA結(jié)合，成為重組DNA分子；將重組DNA導(dǎo)入到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞，并與之一起增殖；同時篩選出帶有重組DNA分子的受體細(xì)胞克隆；從篩選出來的受體細(xì)胞克隆中，提取目的基因供進(jìn)一步分析研究使用；將目的基因克隆到表達(dá)載體并導(dǎo)入寄主細(xì)胞，使之在新的遺傳背景下，實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)。二、基因工程的常用工具1.定義指能把外源DNA（目的基因）導(dǎo)入宿主細(xì)胞，并使之傳代、擴(kuò)增、表達(dá)的工具。

（一）載體（Vector）能夠獨(dú)立自主的復(fù)制，且目的基因的插入不影響載體的復(fù)制能力；具有至少一個單一酶切位點(diǎn)；

具有顯著的遺傳標(biāo)記，便于篩選；

供插入外源基因的片段范圍大，且能穩(wěn)定存在；

載體本身分子量小，拷貝量高；安全。

2.條件按來源分質(zhì)粒（plasmid）

噬菌體（phage）

病毒（virus）3.分類按用途分克隆載體表達(dá)載體4、質(zhì)粒(1)定義是一種存在于細(xì)菌中，獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外的遺傳因子，能夠自主穩(wěn)定獨(dú)立復(fù)制的共價閉環(huán)的雙鏈DNA，一般對細(xì)菌的生存無影響。

(2)分類：根據(jù)拷貝數(shù)可將質(zhì)粒分成兩種不同的復(fù)制型

“嚴(yán)緊型”質(zhì)粒（stringentplasmid）

“松弛型”質(zhì)粒（relaxedplasmid）(3)命名

eg：pBR322“P”------表示是一種質(zhì)粒plasmid“BR”----分別取自該質(zhì)粒的兩位主要構(gòu)建者

F.Bolivar和R.L.Rodriguez姓氏的第一個字母322------指實(shí)驗(yàn)編號，以與其它質(zhì)粒載體如：

PBR325、PBR327等相區(qū)別(4)舉例

pBV220優(yōu)點(diǎn)：1.

個體較小（幾個kb），易于獲得；2.

含有顯著的遺傳標(biāo)記通常有2個以上；3.

拷貝數(shù)高；4.

易于導(dǎo)入外源基因，易于進(jìn)入宿主細(xì)胞并穩(wěn)定存在；

缺點(diǎn)：可插入的外源片段小10kb以下。特點(diǎn)5、噬菌體載體λ噬菌體及其衍生物單鏈?zhǔn)删wM13

粘尾質(zhì)粒（cosmid）等猴多瘤病毒40（SV40）

腺病毒

逆轉(zhuǎn)錄病毒等

6、病毒載體.噬菌體（phage）DNA

λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)

λgt系列（插入型，適用cDNA克?。?/p>

EMBL系列（置換型，適用基因組克?。?/p>

M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因）

M13mp系列

pUC系列柯斯質(zhì)粒（cosmid）

酵母人工染色體載體 （yeastartificialchromosome,YAC）

細(xì)菌人工染色體 （bacterialartificialchromosome,BAC）

動物病毒DNA改造的載體 （如腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄 病毒）（二）工具酶基因的分離和重組，涉及到一系列相互關(guān)聯(lián)的酶促反應(yīng)，已知道有許多重要的核酸酶（如限制性核酸內(nèi)切酶、連接酶、聚合酶、末端轉(zhuǎn)移酶等等）在基因克隆實(shí)驗(yàn)中有著廣泛的用途。而其中限制性核酸內(nèi)切酶和連接酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，才真正使DNA分子的體外切割與連接成為可能，是DNA重組技術(shù)賴以創(chuàng)立的重要酶學(xué)基礎(chǔ)。1、限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）

定義是一類能識別雙鏈DNA分子中某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。常形象地稱之為核酸分子的“手術(shù)刀”。命名

eg：EcoRI、HindⅢ分型

識別DNA的特異序列，并在識別位 點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。 是細(xì)菌內(nèi)存在的保護(hù)性酶。分為I、II、III三類。II類酶識別序列特點(diǎn)為回文結(jié)構(gòu)。

······GGATCC······ ······CCTAGG······特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型限制和修飾活性同時具有內(nèi)切酶、核酸內(nèi)切酶類似I，多功能酶甲基化酶活性

酶的蛋白結(jié)構(gòu)3種不同的亞基單一的成分2種不同的亞基

所需的輔助因子

ATP、Mg2＋、Mg2＋ATP、Mg2＋、S-腺苷甲硫氨酸S-腺苷甲硫氨酸切割位點(diǎn)在距特異性位點(diǎn)至少位于特異性位點(diǎn)距特異性位點(diǎn)3’端

1000bp的地方可能隨或其附近24～26bp處機(jī)地切割序列特異的切割否是是在DNA克隆中的無用十分有用用處不大用處

核酸內(nèi)切限制酶的類型及其主要特性

活性單位

在一定的反應(yīng)條件下（pH、溫度、離子濃度等）和時間內(nèi)(60分鐘)能夠完全酶解1μg的DNA分子底物所需的酶量

識別、切割序列

能識別由4～8個核苷酸組成的特定的核苷酸序列（稱為核酸內(nèi)切限制酶的識別序列）兩條鏈上的斷裂位置是交錯的、但又是對稱地圍繞著一個對稱軸排列，形成所謂粘性末端DNA片段

EcoRI↓

5’－G┆AATTC－3’5’－GAATTC－3’

3’－CTTAA┆G－5’3’－CTTAAG－5’

↑PstI↓

5’－CTGCA┆G－3’5’－CTGCA

G－3’

3’－G┆ACGTC－5’

3’－G

ACGTC－5’

↑斷裂類型兩條鏈的斷裂位置是處在一個對稱結(jié)構(gòu)的中心，形成平末端的DNA片段。

HaeⅢ

↓

5’－G-G－C-C－3’

5’－G-G

－3’

5’－

C-C－3’

3’－C-C－G-G－5’

3’－C-C

－3’

5’－

G-G－5’

↑

5′-端突出

粘性末端

3′-端突出

限制性核酸內(nèi)切酶識別序列長度為4~8個bp。

不同酶切產(chǎn)生的相同粘性末端稱配伍末端（compatibleend），可用連接酶連接。

限制性核酸內(nèi)切酶作用后產(chǎn)生兩種末端：

鈍性末端(bluntend)粘性末端(stickyend)星號活力（staractivity）

在一些非標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下，限制性核酸內(nèi)切酶能夠識別和切割與其特異性識別序列相類似的序列，使切割的特異性下降。

導(dǎo)致星號活力的產(chǎn)生因素高濃度的限制性核