植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告植物NR活力測(cè)定

實(shí)驗(yàn)報(bào)告課程名稱：植物生理學(xué)及實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)類型:探索、綜合或驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目名稱：植物NR活力測(cè)定 體內(nèi)法（活體法）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵笳莆阵w內(nèi)法測(cè)定植物組織中的硝酸還原酶原理和方法，明確誘導(dǎo)酶含義。二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和原理實(shí)驗(yàn)原理：硝酸還原酶是植物氮元素代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶，與作物的吸收和利用氮元素有關(guān)，他們作用于硝酸根，使之還原為亞硝酸根：NO-+NADH++H+nr.NO-+NAD++HO3 二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和原理實(shí)驗(yàn)原理：硝酸還原酶是植物氮元素代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶，與作物的吸收和利用氮元素有關(guān)，他們作用于硝酸根，使之還原為亞硝酸根：NO-+NADH++H+nr.NO-+NAD++HO3 2 2NO,Ji植物細(xì)胞 、NADFV―__"燉 no3外界溶液NO.測(cè)定原理：根產(chǎn)生的亞硝酸根可以從組織內(nèi)滲入到外界溶液中，從而測(cè)定溶液中亞硝酸根的含量的增加。磺胺先與亞硝酸鈉形成重氮鹽，再與a-奈氨偶聯(lián)形成紫色物質(zhì)。反應(yīng)液的酸度和溫度都會(huì)對(duì)反應(yīng)產(chǎn)生影響。三、主要儀器設(shè)備1.N。次橫胺+O-兼基乙烯二胺*1.!紅色化合物后加!540mn最大吸收峰測(cè)定。D2.3.材料：在20°C蒸餾水培養(yǎng)一周小麥苗組加KNO3，一組加0.5mMCaCl2，在白天置光照下處理。試劑：磺胺試劑、萘基乙烯二胺溶液，酶促反應(yīng)液（PBs+KNO）器材：分光光度計(jì)、注射器、試管、天平、燒杯、移液管、恒溫箱實(shí)驗(yàn)前一天分兩組，一四、操作方法與實(shí)驗(yàn)步驟事先制作好NO-標(biāo)準(zhǔn)曲線。2在20°C蒸餾水培養(yǎng)一周小麥苗，實(shí)驗(yàn)前一天分兩組，一組加KNO3,一組加0.5mMCaCl2，在白天置光照下處理。 '取各組苗地上部約0.5g左右,切成合適長(zhǎng)度（1cm左右），放入50mL注射器中。加酶促反應(yīng)液10ml，抽氣直到材料完全下沉（一只手戴上手套，用戴手套的食指封住注射器頭，另一只手反復(fù)推拉抽氣減壓，將葉片中的空氣趕盡，直到材料完全下沉）。置恒溫箱30C20min，取出后將反應(yīng)液注射入燒杯中。取4ml反應(yīng)過(guò)的液體，加磺胺溶液2ml+萘基乙烯二胺溶液2ml,室溫放置5min后測(cè)540nmOD。五、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄和處理NO-標(biāo)準(zhǔn)曲線2442y=A0062x4-0.442y=A0062x4-0.0283R3=0.99620 3。 60SO130150NQf含量CniiDl)o.o.o.o.1802.取苗上部重量OD540值對(duì)照組0.52g0.115處理組六、實(shí) —0.51g0.280驗(yàn)結(jié)果與分析NO-標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=0.0062x+0.0283(R2=0.9962)2對(duì)照組NO2-(nmol)=(0.115-0.0283)/0.0062=13.98處理組NO：-(nmol)=(0.280-0.0283)/0.0062=40.60NR活力(No-生成nmol/(鮮重g.h))2=NO2-(nmol)X3X(10/4)/實(shí)際重量g對(duì)照組NR活力=13.98*3*2.5/0.52=201.63nmol/g.h)處理組NR活力二40.60*3*2.5/0.51二597.06nmol/g.h)七、討論、心得1.比較KNO3誘導(dǎo)和加NH4Cl的NR活力大小，誘導(dǎo)時(shí)如用NaNO,替

代KNO結(jié)果會(huì)如何，為什么？ 3如不進(jìn)3行光照，結(jié)果會(huì)怎么樣，為什么？A.如用NaNO替代KNO，那么光合呼吸作用減弱，酶的活力降低，從而影響硝酸根3轉(zhuǎn)化為亞硝酸根，實(shí)驗(yàn)中可能兩組紫紅取材質(zhì)量OD540值處理后液體顏色NO-(nmol)NR活力(nmol/g.h)CK0.52g0.115有輕微紫色13.98201.63處理組0.51g0.280顏色較紫40.60597.06色的顏色差別很小，使測(cè)得的還原酶活力偏低。原因：K+離子可以調(diào)節(jié)滲透，氣孔開(kāi)閉，促進(jìn)氧化磷酸化，另外鉀火花呼吸作用和光合作用的酶的活性，是40多種酶的輔助因子，是形成細(xì)胞膨脹和維持細(xì)胞內(nèi)電中性的主要陽(yáng)離子。而Na+離子雖然可以部分地代替鉀的作用，但不能完全替代。B.如不進(jìn)行光照，結(jié)果可能是兩則的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相差不大，而且所測(cè)定的還原酶的活力都很低。原因：之前的呼吸作用已經(jīng)消耗大量的糖類，而在沒(méi)有光合作用的條件下，苗儲(chǔ)存的糖類很少，所以呼吸作用會(huì)大大減弱，使酶活力比預(yù)期結(jié)果低，兩組亞硝酸鹽含量相差不多。亞硝酸是過(guò)多施用氮肥后蔬菜中積累的致癌物質(zhì)，請(qǐng)根據(jù)本實(shí)驗(yàn)寫(xiě)出簡(jiǎn)易測(cè)定蔬菜亞硝酸含量的方法。取待測(cè)蔬菜的組織，用酶促反應(yīng)液浸提，取適量的反應(yīng)液加磺胺和萘基乙烯二胺溶液，靜置后觀察顏色深淺。若顏色越深，則代表蔬菜中亞硝酸含量較多；反之，則較少。

光譜法和色譜法精度高，但是對(duì)儀器或者實(shí)驗(yàn)條件要求較高，不符合簡(jiǎn)易測(cè)定的要求1。Table2不同光譜法測(cè)定硝酸鹽和亞硝酸鹽的比較方法名禰 優(yōu)點(diǎn) 缺點(diǎn)些密外希*府洋噪僧簡(jiǎn)單'準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)4紫外分光光度法 定性、定置和痢伽格里斯分光光度法簡(jiǎn)便'快速’鷲爵’窿1為L(zhǎng)苯酚分光光度法 快速、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確系例馨囊長(zhǎng)分 準(zhǔn)確，精密度高幾1兀俄，有網(wǎng)F引 儀器簡(jiǎn)單,操作簡(jiǎn)便,易于:/沼L 分析，分析速度快，帝密j寸乳兀*成 試劑、試樣用登少，適用'性好，能準(zhǔn)珈度不高，有的1低 有限制性，不可,單性好r精磷度有限，椎測(cè)性;耗時(shí),易受其他雜另準(zhǔn)確度有限，易受剝操作繁瑣莊續(xù)自動(dòng)靈蚊度有限，檢瀏極眼;變高，定性有限*限于分析電隹較廣 化學(xué)成分階段U有限，i干擾旋干擾有限.穩(wěn)1簡(jiǎn)單的Table1不同色譜法測(cè)定硝酸鹽和亞硝酸鹽的比較方法名稱優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)HPLC快速、準(zhǔn)胡、靈敏度高、靖密度高所用試劑有毒，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員

與環(huán)境有危害，費(fèi)用高儀器昂貴儀器昂貴簡(jiǎn)便、選擇性好、靈敏度高'準(zhǔn)醐

度高、分析速度快，?欲丑樣能同

時(shí)測(cè)定多種I畀高子GC操作簡(jiǎn)便，抗干也能力強(qiáng)'

線性范圍寬.檢出限值具有局限性，儀器昂貴,

需要專業(yè)技術(shù)人員現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)法：方法能夠應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)，并在30min內(nèi)出具檢測(cè)結(jié)果。主要是根據(jù)亞硝酸鹽與顯色劑的顯色反應(yīng)來(lái)測(cè)定亞硝酸鹽的含量，一般采用試紙、試劑盒等形式。李健2等根據(jù)顯色劑顯色反應(yīng)測(cè)吸光度的原理研制出一種可以快速、簡(jiǎn)便、靈敏、安全的針對(duì)亞硝酸鹽國(guó)際限量(4mg/kg)的試劑盒，用于檢測(cè)蔬菜中亞硝酸鹽的含量，可以滿足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需要。亞硝酸根試紙、試劑盒具有體積小、便于攜帶、檢測(cè)方便、成本低廉等特點(diǎn)，具有