應(yīng)用珠磨-cab法提取瘤胃微生物總dna的研究

應(yīng)用珠磨-cab法提取瘤胃微生物總dna的研究

反芻動物腫瘤胃是一個極其復(fù)雜的共生生態(tài)系統(tǒng)。瘤胃微生物種類繁多,包括瘤胃原蟲、瘤胃細(xì)菌和厭氧真菌,還有少數(shù)的噬菌體,其中細(xì)菌的數(shù)量在瘤胃中占有很大比例。這些微生物具有多種生理功能,可以幫助反芻動物消化纖維素同時合成大量的菌體蛋白,為反芻動物提供正常生命活動所必需的營養(yǎng)物質(zhì)。目前對瘤胃微生態(tài)的研究一直是熱點(diǎn),但由于瘤胃環(huán)境的特殊性如需要嚴(yán)格的厭氧條件和復(fù)雜的營養(yǎng)因子,并且瘤胃中絕大多數(shù)的微生物不能或是很難在體外培養(yǎng),即便分離培養(yǎng)出的微生物也有可能不是所期望的瘤胃中的優(yōu)勢種群,傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)對瘤胃微生物多樣性的研究存在著局限性。近年來,隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展,許多學(xué)者采用在基因組水平上對復(fù)雜的瘤胃微生物進(jìn)行分析,克服了傳統(tǒng)培養(yǎng)的局限性,為深入研究瘤胃微生態(tài)提供了新的思路和方法。然而通過分子手段對瘤胃微生物研究的基礎(chǔ)和關(guān)鍵的一步是對微生物DNA的提取,目前報(bào)道的對瘤胃微生物DNA提取方法有多種,如物理方法珠磨儀破碎法、反復(fù)凍融SDS/蛋白酶K法、液氮研磨法等,與化學(xué)方法CTAB、SDS等。瘤胃微生物種類復(fù)雜多樣,單一的提取方法很難獲得完整的微生物DNA片段。基于此,本試驗(yàn)旨在通過將常用幾種提取微生物DNA的方法進(jìn)行綜合比較,探討影響微生物DNA提取效果的重要因素,優(yōu)化出一種最有效的瘤胃微生物DNA的提取方法。1材料和方法1.1材料表面1.2蛋白酶、瓊脂糖十二烷基磺酸鈉(SDS)、十六烷基三甲溴化胺(CTAB)、蛋白酶K、瓊脂糖,均購自Sigma。其他國內(nèi)生產(chǎn)的化學(xué)試劑均為分析純級。引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成,引物序列如下表1。1.3主要設(shè)備1.4方法1.4.1過濾-過濾液組采集瘤胃內(nèi)容物及瘤胃液,混勻,然后4層紗布過濾,濾液10000g離心5min,棄上清,沉淀用生理鹽水溶解,放置-70℃保存。1.4.2dna的提取珠磨-CTAB法:取荷斯坦奶牛的瘤胃內(nèi)容物及其瘤胃液1.5mL加入到裝有0.3g玻璃碎珠的小型離心管中,在12000g的條件下離心5min,除去上清;加入1.5mL的PBS溶液在12000g的條件下離心5min,除去上清;加入800μLCTABBuffer(4gCTAB、16.364gNaCl、1mol/LTris·HCl20mLpH8.0、0.5mol/LEDTA8mL,定容至200mL滅菌)Beat120s。在70℃條件下培養(yǎng)20min,然后在10000g條件下離心10min。將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中,加入5μL的RNA酶(10mg/mL)在37℃條件下培養(yǎng)30min;加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)溶液振蕩(15~30s)呈白色乳濁液。13000r/min條件下離心10min,取上清加入到新的離心管中。再用等體積酚∶氯仿∶異戊醇抽提直至界面清晰為止。加入0.8體積的異丙醇輕輕上下混勻幾次。在室溫條件下放置5min讓DNA沉淀在-20℃過夜。在13000r/min條件下離心15~20min。小心倒出上清?？梢钥吹交野咨腄NA沉淀。加入750μL70%的冷乙醇,將白色沉淀輕輕彈起。在13000r/min條件下離心10~15min。倒出上清,風(fēng)干DNA。加入100μL的TEBuffer(視沉淀體積而定)在70℃條件下5min。用分光光度計(jì)測定DNA的濃度。珠磨-SDS法:SDSbuffer成分如下:100mmol/LNaCl、500mmol/LTris·HClpH8.0、10%SDS,其他提取過程同珠磨-CTAB方法。反復(fù)凍融-CTAB法:參照文獻(xiàn)凍融法和Murray等提出的CATB方法,將凍融法和CATB法相結(jié)合。步驟如下:取荷斯坦奶牛瘤胃內(nèi)容物及其瘤胃液0.5mL置于滅菌的2mL離心管中;加入400μLDNA抽提緩沖液(100mmol/LTris·HCl,pH8.0;100mmol/LEDTA;100mmol/L磷酸鈉緩沖液,pH8.0;1.5mo1/LNaCl;1%CTAB)充分混勻,置液氮中完全凍結(jié)溫至融化;重復(fù)該步驟2次(液氮中冷凍約3~5min),取出在60℃水浴中保溫至融化;重復(fù)該步驟2次,共3次;60℃保溫1h,每隔15~20min顛倒混勻幾次;加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1),10000g,4℃離心10min;上清液轉(zhuǎn)移至一新的離心管中,重復(fù)2次如上清液仍渾濁,可增加1次;上清液中加1/10倍體積3mol/L乙酸鈉(pH7.0)及2倍體積冷無水乙醇,輕輕混勻,置于-20℃過夜;10000g,4℃離心15min;沉淀用70%乙醇和冷無水乙醇各洗1次,自然干燥;沉淀用100μLTE(pH8.0)溶解;將其DNA原液進(jìn)行稀釋后,取3μL在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳,觀察DNA純度,用分光光度計(jì)測定DNA的濃度。其余DNA置于-20℃下保存?zhèn)溆?。反?fù)凍融-SDS(蛋白酶K)法:取荷斯坦奶牛瘤胃內(nèi)容物及其瘤胃液0.5mL置于滅菌的2mL離心管中;加900μLSDS提取液(100mmol/LNaCl、500mmol/LTris·HClpH8.0、10%SDS),置液氮中完全凍結(jié)溫至融化;重復(fù)該步驟2次,(液氮中冷凍約3~5min),取出在60℃水浴中保溫至融化;重復(fù)該步驟2次,共3次;加入120μL蛋白酶K(20mg/mL)。60℃保溫1h,每隔15~20min顛倒混勻幾次;6000g室溫離心10min;收集上清液,加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1),10000g,4℃離心10min;上清液轉(zhuǎn)移至一新的離心管中,重復(fù)2次如上清液仍渾濁,可增加1次;上清液中加1/10倍體積3mol/L乙酸鈉(pH7.0)及2倍體積冷無水乙醇,輕輕混勻,置于-20℃過夜;10000g,4℃離心15min;沉淀用70%乙醇和冷無水乙醇各洗1次,自然干燥;沉淀用100μLTE(pH8.0)溶解;將其DNA原液進(jìn)行稀釋后,取3μL在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳,觀察DNA純度,用分光光度計(jì)測定DNA的濃度。其余DNA置于-20℃下保存?zhèn)溆?。液氮研?CTAB法:先將瘤胃液樣品中加入適量液氮,在滅菌的研缽上快速研磨,然后加入抽提液CTABBuffer(100mmol/LTris·HCl,pH8.0;100mmol/LEDTA;100mmol/L磷酸鈉緩沖液,pH8.0;1.5mo1/LNaCl;1%CTAB)。反復(fù)顛倒數(shù)次,然后離心取上清。6000r/min,離心5min,取上清,加20mg/mL蛋白酶K10μL,65℃水浴,30min,然后再加等體積酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提2次,12000g,4℃離心2min。取上清加2倍冷乙醇,沉淀1h,16000g,4℃離心10min,棄上清。用70%乙醇洗滌沉淀,晾干,用TE(pH8.0,含10mg/μLRNase)溶解,放置37℃水浴30min。酚和氯仿抽提1次,12000g,4℃離心2min。上清加2倍體積乙醇,過夜。16000g,4℃離心10min,棄上清。70%乙醇洗滌沉淀,晾干,溶于TE(pH8.0)。液氮研磨-SDS法:SDSBuffer成分:100mmol/LNaCl、500mmol/LTris·HClpH8.0、10%SDS,其他提取過程同CTAB法方法。1.5粗提dna檢測用紫外分光光度計(jì)于260、280nm波長下測定粗提DNA吸光值及濃度,計(jì)算出OD260/OD280值。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。1.6腫瘤胃微生物dna的pcr檢測1.6.1pcr反應(yīng)體系及參數(shù)引物F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;引物R:5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′PCR反應(yīng)體系為10×緩沖液2.5μL,10mmo1/L的dNTP2.5μL,10μmol/L的引物各1.0μL,25mmol/L的MgC12為2.5μL,模板(瘤胃總DNA)2.5μL,TaqDNA聚合酶0.5μL,雙蒸水為12.5μL,總體積25μL。反應(yīng)參數(shù):94℃變性3min;94℃40s;54℃50s;72℃2min;35個循環(huán);72℃延伸10min。1.6.2pcr反應(yīng)參數(shù)引物F:5′-ACKGCTCAGTAACACGT-3′;引物R:5′-GTGCTCCCCCGCCAATTCCT-3′。PCR反應(yīng)體系為10×緩沖液2.5μL,10mmo1/L的dNTP2.5μL,10μmol/L的引物各1.0μL,25mmol/L的MgC12為2.5μL,模板(瘤胃總DNA)2.5μL,TaqDNA聚合酶0.5μL,雙蒸水為12.5μL,總體積25μL。反應(yīng)參數(shù):95℃變性4min;95℃1min;60℃1min;72℃1min;35個循環(huán);72℃延伸7min。2結(jié)果與分析2.1反復(fù)凍融-sds法與ctab法由圖1可以看到,珠磨-CTAB法提取的DNA具有較亮的條帶,然而珠磨-SDS法提取的DNA條帶明顯具有拖尾現(xiàn)象,說明DNA降解十分嚴(yán)重。并且在該方法的凝膠泳道前部,可見較亮的RNA譜帶,說明提取物中存在未降解完全的RNA,需要進(jìn)行下一步的純化。圖2為反復(fù)凍融法與CTAB和SDS2種化學(xué)方法結(jié)合提取的DNA電泳圖,通過條帶可見反復(fù)凍融-CTAB提取的DNA的質(zhì)量優(yōu)于反復(fù)凍融-SDS法。同時在電泳點(diǎn)樣膠孔中含有很多的多糖和大分子不明雜質(zhì),并且后者提取的DNA仍有一定的降解。圖3為液氮研磨法與CTAB和SDS2種化學(xué)方法結(jié)合提取的DNA電泳圖,可見這2種方法提取DNA條帶亮度微弱,并且RNA仍未降解完全,同時在點(diǎn)樣仍存在大量不明雜質(zhì)。2.2檢測dna濃度2.3dna擴(kuò)增效果左右的瘤胃細(xì)菌和古細(xì)菌的16SrDNA序列。與試驗(yàn)預(yù)計(jì)擴(kuò)增的片段長度一致,通過條帶可以看出DNA擴(kuò)增效果穩(wěn)定,重復(fù)性好。檢測結(jié)果說明利用珠磨-CTAB法可以得到瘤胃微生態(tài)中絕大部分微生物的基因組DNA,可以進(jìn)行下一步分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。3鹽析法提取瘤胃是一個含有復(fù)雜微生物群體的厭氧環(huán)境,由于它本身具有復(fù)雜性同時對厭氧條件的要求極高,因此大多數(shù)瘤胃微生物在體外難以成功培養(yǎng)。隨著分子生物學(xué)方法的發(fā)展,直接從樣品中提取微生物DNA可以克服傳統(tǒng)培養(yǎng)的弊端。在本試驗(yàn)中,幾種方法提取出DNA濃度的不同,分析其原因可能在于對菌群細(xì)胞裂解存在差異以及對微生物DNA的破碎程度不同,在提取DNA過程中,細(xì)胞裂解的過程是非常重要的,因細(xì)胞結(jié)構(gòu)及其所含成分不同,樣品中細(xì)胞裂解的程度也有所不同。采用SDS裂解液來溶解細(xì)胞膜中的脂溶性物質(zhì),促使細(xì)胞膜破裂,釋放DNA,但同時沉淀大量的多糖。利用非離子型去污劑CTAB結(jié)合玻璃珠破碎法則減少了雜質(zhì)的生成,同時微生物DNA沒有大量降解,效果最佳,較適合對瘤胃微生物DNA的提取。試驗(yàn)結(jié)果表明,采用珠磨-CTAB法提取獲得的瘤胃微生物總DNA結(jié)果優(yōu)于其他方法,粗提DNA的產(chǎn)量達(dá)到905.1μg/mL,OD260/OD280值在1.8以上,PCR擴(kuò)增細(xì)菌與古菌的16SrDNA片段達(dá)到了預(yù)期的結(jié)果。李旦等報(bào)道,珠磨法與反復(fù)凍融法結(jié)合化學(xué)提取液,可以獲得比較完整的瘤胃微生物DNA,但本試驗(yàn)利用反復(fù)凍融法所提取的DNA在電泳點(diǎn)樣膠孔中含有很多的多糖和大分子不明雜質(zhì),這可能是在利用化學(xué)裂解液破碎細(xì)胞膜時,釋放DNA的同時沉淀了大量的多糖和蛋白。反復(fù)凍融法在提取環(huán)境微生物及海洋微生物DNA中的應(yīng)用較為廣泛。液氮研磨法雖然也能獲得DNA,但在本試驗(yàn)中提取的DNA濃度較低,效果不穩(wěn)定。因?yàn)檫@種方法有很多外界因素的影響,比如研磨過程中的力度大小在一定程度上影響了對微生物的破碎程度,所以只適用于對瘤胃微生物小范圍內(nèi)的研究。珠磨-CTAB法鑒于有些瘤胃微生物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)特殊且較難裂解,以玻璃珠機(jī)械破壁為主,使用CTAB相結(jié)合來裂解消化細(xì)胞,兼顧大多數(shù)瘤胃微生物特性。在利用玻璃珠震蕩樣品時,需注意震蕩時間不宜過長,如果震蕩時間過長,會導(dǎo)致提取的DNA斷裂成更多的片段,影響后續(xù)的試驗(yàn)研究。在試驗(yàn)的操作過程中應(yīng)盡量避免污染,使獲得的基因組DNA能夠代表瘤胃微生物而不被其他來源的DNA干擾。4pcr和布署對瘤胃細(xì)菌和古細(xì)菌的16srdna片段的檢測本試驗(yàn)對常用的提取瘤胃微生物基因組DNA的方法進(jìn)行了綜合比較。從DNA提取的效果看,珠磨-CTAB法可以獲得比較完整的瘤胃微生物總DNA片段。同時對樣品中提取的DNA進(jìn)行微生物16SrDNA的PCR擴(kuò)增分析證明了該方法獲得很好的效果,可以成功的擴(kuò)增出瘤胃細(xì)菌和古細(xì)菌的16SrDNA片段。因此可以說明珠磨-CTAB法的適用性達(dá)到了分子生物操作的要求。瘤胃內(nèi)容物取自裝有永久性瘤胃瘺管的荷斯坦奶牛。高速臺式離心機(jī)、電熱恒溫水