白芍總苷對(duì)糖尿病大鼠腎組織jaksa信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用

白芍總苷對(duì)糖尿病大鼠腎組織jaksa信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用

糖尿病性腎衰竭（dn）是糖尿病的主要微血管并發(fā)癥之一，其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。近年來，炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激對(duì)發(fā)病機(jī)制的影響日益受到關(guān)注。Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子(JAK/STAT)介導(dǎo)的生長(zhǎng)因子和炎癥因子的信號(hào)途徑被認(rèn)為在其中發(fā)揮了重要作用。白芍總苷是我國(guó)傳統(tǒng)中藥白芍根中提取的有效部位，其藥理作用主要有抗炎、抗氧化與免疫調(diào)節(jié)活性。我們先前的研究已表明TGP對(duì)糖尿病大鼠腎臟有明顯保護(hù)作用，我們現(xiàn)在的研究觀察了TGP對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病腎臟JAK/STAT通路激活的影響，旨在進(jìn)一步探討TGP對(duì)糖尿病腎臟保護(hù)作用的可能機(jī)制。1材料和方法1.1材料表面1.1.1g：動(dòng)物中心50只昆明種SD雄性大鼠，體重180～200g，安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。在室溫（22.0±2.0）℃、相對(duì)濕度（55.0±5.0）%、光照周期12h-12h環(huán)境中適應(yīng)飼養(yǎng)1周后實(shí)驗(yàn)。1.1.2羧甲基纖維素鈉p-jat3和tgf-1iiiSTZ系Sigma公司產(chǎn)品，臨用前溶解在0.01md/L枸椽酸緩沖液中，pH4.5;TGP為安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所魏偉教授惠贈(zèng)，用前溶于1%的羧甲基纖維素鈉溶液中；尿白蛋白測(cè)定試劑盒購(gòu)自法國(guó)SPI公司；兔抗p-JAK2多克隆抗體、小鼠抗p-STAT3(B-7)單克隆抗體與兔抗TGF-β1多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)SantaCruz公司；免抗大鼠1α（IV）型膠原、生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG、辣根過氧化酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔或小鼠IgG及鏈酶親和素-生物素復(fù)合物（SABC）購(gòu)自武漢博士德公司；硝酸纖維膜購(gòu)自美國(guó)Amersham公司；ECL發(fā)光試劑購(gòu)自Pierce公司。1.2方法1.2.1糖尿病大鼠血糖等指標(biāo)檢測(cè)大鼠腹腔一次性注射STZ65mg/kg,48～72h后尾靜脈采血，應(yīng)用血糖儀測(cè)定全血血糖，隨機(jī)血糖16.7mmol/L以上確定為糖尿病大鼠，對(duì)照組僅注射等量枸櫞酸緩沖液。1.2.2灌胃給藥，給予劑量溶媒大鼠隨機(jī)分：對(duì)照組（C,n=10）、模型組（DM,n=10）、TGP給藥組（DM+TGP,n=30）。選擇TGP50、100和200mg/（kg·d）灌胃給藥，對(duì)照組和糖尿病組給予等量溶媒。所有大鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間喂標(biāo)準(zhǔn)飲食，自由飲水，不應(yīng)用胰島素，觀察8周。1.2.3腎組織中人馬特征組化大鼠處死前1天放入代謝籠（蘇州新區(qū)楓橋?qū)嶒?yàn)動(dòng)物籠具廠產(chǎn)品）中準(zhǔn)確收集24h尿液，離心分裝后保存于-70℃冰箱中待測(cè)尿白蛋白含量。然后在戊巴比妥腹腔注射麻醉下行右側(cè)頸總動(dòng)脈插管收集血標(biāo)本，4℃離心取血漿保存于-20℃待測(cè)血糖水平。通過右側(cè)頸總動(dòng)脈插管注入4℃預(yù)冷的生理鹽水反復(fù)灌洗腎臟后游離，置于冰上，取8mm3大小腎組織置于4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋，制成厚度為3μm多聚賴氨酸處理切片，進(jìn)行免疫組化研究。剩余腎組織分別切成小塊，置于液氮中，凍透后轉(zhuǎn)入-70℃冰箱中待測(cè)。1.2.4尿白測(cè)量采用EIA測(cè)定尿白蛋白含量，24h尿白蛋白排泄率（AER）為尿白蛋白含量與24h尿量乘積。1.2.5肌肉注射和sst檢測(cè)取100mg腎組織置入裂解液0.25mL勻漿，4℃，12000×g離心2min，取上清液測(cè)蛋白濃度。取30μg蛋白煮沸5min后，經(jīng)6%SDS電泳，電轉(zhuǎn)移至NC膜上，在5%脫脂奶粉-PBST溶液室溫下封閉1h，洗膜后加入兔抗p-JAK2多克隆抗體（1∶800）、小鼠抗p-STAT3單克隆抗體（1∶1000）、免抗大鼠1α（IV）型膠原抗體（1∶1000)4℃過夜，再用HRP標(biāo)記的二抗雜交，37℃，1h。洗膜后在暗室中加ECL發(fā)光試劑，X光膠片暴光1、2min后顯影、定影，雜交信號(hào)在圖象分析系統(tǒng)中進(jìn)行光密度掃描。應(yīng)用管家基因β-actin作為蛋白上樣量對(duì)照，其余組與其相比得到相對(duì)量，取均值。1.2.6小鼠肝腎免疫組化采用SABC方法：切片常規(guī)脫蠟，用3%H2O2甲醇封閉內(nèi)源性過氧化酶，應(yīng)用微波爐暴露抗原后封閉內(nèi)源性生物素。加兔抗大鼠TGF-β1(1∶100）多克隆抗體，4℃過夜，再加生物素化羊抗兔IgG(1∶200），室溫30min，滴加SABC，室溫30min，滴加DAB顯色液，鏡下控制著色時(shí)間。實(shí)驗(yàn)采用刪除第一抗體作陰性對(duì)照。陽(yáng)性物質(zhì)呈棕色顆粒狀，腎小球TGF-β1免疫組化結(jié)果判斷按下列方法進(jìn)行半定量評(píng)分：0=微弱或無染色；1=染色面積<25.0%；2=染色面積25.0%～50.0%；3=染色面積50.0%～75.0%；4=染色面積>75.0%。腎小管-間質(zhì)TGFβ1免疫組化結(jié)果判斷應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)，計(jì)算其陽(yáng)性面積占腎小管-間質(zhì)面積百分比（%），取均值進(jìn)行比較。1.3免疫組化半定量評(píng)分正態(tài)分布資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。AER為非正態(tài)分布資料，采用對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后，用幾何均數(shù)×/÷耐受因子表示。腎小球TGF-β1免疫組化半定量評(píng)分為非正態(tài)分布資料，采用中位數(shù)表示。應(yīng)用SPSS11.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，參數(shù)資料采用One-WayANOVA檢驗(yàn)，非參數(shù)資料中采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1模型大鼠腎重、血糖、tgp的比較模型組大鼠表現(xiàn)為血糖升高、體重下降、相對(duì)腎重（腎重/體重）增加，TGP(50,100和200mg/kg）給藥8周沒有防止模型組大鼠血糖升高與體重下降。TGP(50,100和200mg/kg）給藥組大鼠相對(duì)腎重與模型組相比有所下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型組大鼠AER明顯高于對(duì)照組，TGP50、100和200mg/kg給藥8周大鼠AER水平明顯低于模型組。見表1。2.2tgp對(duì)腎組織p-jat3蛋白表達(dá)的影響Western雜交條帶光密度分析顯示模型組腎組織p-JAK2與p-STAT3蛋白表達(dá)較對(duì)照組分別增加1.4和4.5倍，TGP50、100和200mg/kg給藥8周可使腎組織p-JAK2蛋白表達(dá)下降22.3%、50.5%與43.2%，p-STAT3蛋白表達(dá)下降20.9%、61.1%與42.3%。見圖1。2.3tgp對(duì)腎組織1iii型膠原蛋白表達(dá)的影響Western雜交條帶光密度分析顯示模型組腎組織1α（IV）型膠原蛋白表達(dá)較對(duì)照組增加2.7倍，TGP50、100和200mg/kg給藥8周可使腎組織1α（IV）型膠原蛋白表達(dá)分別下降47.9%、60.4%與72.9%。見圖2。2.4對(duì)小鼠腎-間質(zhì)tgf-1蛋白表達(dá)的影響免疫組化顯示對(duì)照組大鼠腎小球與腎小管-間質(zhì)有微弱TGF-β1蛋白表達(dá)，模型組腎小球與腎小管-間質(zhì)TGF-β1蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組，TGP50mg/（kg·d）給藥組腎小球與腎小管-間質(zhì)TGF-β1蛋白表達(dá)低于模型組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，TGP100和200mg/（kg·d）給藥組腎小球與腎小管-間質(zhì)TGF-β1蛋白表達(dá)明顯低于模型組。見圖3、表2。3糖尿病dn治療作用機(jī)制JAKs家族屬于非受體型酪氨酸蛋白激酶，有JAK1、JAK2、JAK3和TYK2四個(gè)成員，而STATs是JAKs激酶的底物，STAT家族成員主要包括STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5和STAT6。STATs家族可與DNA結(jié)合，并可與JAK等酪氨酸磷酸化信號(hào)通路偶聯(lián)，從而把細(xì)胞外信號(hào)與細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)控直接聯(lián)系起來發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。晚近，F(xiàn)ARHAD等在體外研究發(fā)現(xiàn)高糖培養(yǎng)下的腎小球系膜細(xì)胞p-JAK2和p-STAT3的表達(dá)均顯著增高。AMY等在STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎內(nèi)發(fā)現(xiàn)p-JAK2和p-STAT3的表達(dá)較正常對(duì)照均顯著增加，而JAK1,p-JAK1,JAK2和STAT3的表達(dá)無明顯變化。此外，使用JAK2特異性抑制劑AG-490干預(yù)4～8周，發(fā)現(xiàn)可明顯降低糖尿病大鼠蛋白尿。本研究同樣證實(shí)糖尿病模型組腎組織p-JAK2和p-STAT3表達(dá)明顯高于對(duì)照組，這些研究表明JAK/STAT信號(hào)通路在DN的進(jìn)程中發(fā)揮了重要作用。TGF-β1是DN各種致病因素致腎臟損害的最后通路，研究表明高糖和AngII可激活腎小球系膜細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)途徑包括多元醇途徑和活性氧簇的生成，并進(jìn)一步激活JAK/STAT信號(hào)途徑，增加原癌基因c-fos和c-jun的表達(dá)，形成異二聚體AP-1，并活化TGF-β1基因啟動(dòng)子，導(dǎo)致TGF-β1的產(chǎn)生增加。另外，高糖可增強(qiáng)AngII誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎小球JAK2/STAT3信號(hào)途徑的活化，導(dǎo)致TGF-β1和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白IV型膠原表達(dá)進(jìn)一步增加，在糖尿病模型中應(yīng)用AngII受體拮抗劑坎地沙坦和JAK2特異性抑制劑AG-490以及HMG輔酶A還原酶抑制劑干預(yù)，發(fā)現(xiàn)各治療組均可降低蛋白尿，腎內(nèi)p-JAK2和p-STAT3表達(dá)水平均顯著降低，IV型膠原與TGF-β1的表達(dá)亦顯著減少。因此，糖尿病狀態(tài)下，干預(yù)JAK2/STAT3信號(hào)通路激活可能有效地預(yù)防DN發(fā)生、發(fā)展。TGP主要含有芍藥苷、羥基芍藥苷、芍藥花苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷等成分。最近，ZHENG等與ZHU等以AA大鼠和膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜細(xì)胞為靶點(diǎn)，探討了TGP對(duì)G蛋白-AC-cAMP信號(hào)傳導(dǎo)和Ras-MAPKs信號(hào)傳導(dǎo)影響，并揭示了TGP作用的靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)滑膜細(xì)胞G蛋白-AC-cAMP和Ras-MAPKs信號(hào)通路平衡是TGP發(fā)揮抗滑膜細(xì)胞增殖的重要分子機(jī)制，TGP[50、100mg/（kg·d）]可明顯抑制巨噬細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞JNK、p38和ERKMAPK的磷酸化能力，抑制滑膜細(xì)胞過度增殖，這些研究表明TGP的治療作用可能通過調(diào)節(jié)信號(hào)通路途徑，但TGP對(duì)糖尿病腎組織的JAK/STAT信號(hào)通路的影響尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。我們先前的研究已提示TGP對(duì)糖尿病大鼠腎臟有明顯保護(hù)作用，可能部分與抑制糖尿病大鼠腎組織過度表達(dá)的前炎癥介質(zhì)和氧化應(yīng)激有關(guān)，本組現(xiàn)在的研究表明TGP可顯著降低糖尿病腎組織p-JAK2和p-STAT3過高表達(dá)，并進(jìn)一步導(dǎo)致TGF-β1以及IV型膠原的表達(dá)減少，提示TGP對(duì)糖尿病腎臟的保護(hù)作用可能是通過抑制JAK/STAT信號(hào)通路的作用實(shí)現(xiàn)。此外，研究表明氧化應(yīng)激可激活JAK2/STAT3