利用反向遺傳學方法敲除細胞基因

利用反向遺傳學方法敲除細胞基因

絲蟲菌占真菌世界的很大一部分，在工業(yè)、農業(yè)、醫(yī)學和基礎生物學研究中發(fā)揮著重要作用。一些重要的工業(yè)菌株用于生產酶、有機酸等物質,如黑曲霉、綠色木霉等。一些與農業(yè)生產有著重要的關系,既是重要農作物上的病原菌,如稻瘟病菌、棉花黃萎病菌等;又是生防真菌,具有防治植物病蟲害的功能,如綠僵菌、木霉菌等。另一些絲狀真菌在醫(yī)藥上有著舉足輕重的作用,如來源于海洋的絲狀真菌、一種新型的可以產生抑制癌細胞擴散物質的灰綠曲霉(Aspergillusglaucus)。同時,由于絲狀真菌中的構巢曲霉(Aspergillusnidulans)和粗糙鏈孢霉(Neurosporacrassa)基因組相對簡單、可操作性強,可作為“模式”種用于真核生物的一些生物學特性研究。隨著大量絲狀真菌基因組序列的測定以及高效分子研究手段的發(fā)展,以基因功能鑒定為目標的功能基因組學已經成為目前生命科學領域研究的熱點。目前已有一些方法用于絲狀真菌基因功能的研究,如轉座子標簽法、基因敲除技術、RNA干擾、超表達及酵母雜交系統(tǒng)等。其中基因敲除技術能夠有效和特異性地抑制目標基因的表達,操作簡單易行,是構建許多真菌基因突變體的首選技術,故應用十分廣泛。1995年PaulBundock首次應用農桿菌實現(xiàn)了對釀酒酵母的轉化,1998年deGroot等構建了農桿菌介導(Agrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformation,ATMT)絲狀真菌轉化體系。該方法操作簡單、受體范圍廣、轉化效率高、單拷貝率高及突變體遺傳穩(wěn)定,解決了傳統(tǒng)轉化方法的瓶頸。農桿菌介導的遺傳轉化方法已是目前實現(xiàn)真菌遺傳轉化應用最廣泛的方法之一。利用該方法成功轉化的真菌已有100種,而且已有多種真菌利用該方法構建了含豐富類型轉化子的突變體庫,通過突變體表型來篩選特定的基因。另外,隨著真菌基因組測序的完成,使得ATMT結合反向遺傳學的方法定向分析基因的功能成為了可能。1基因打靶技術基因敲除技術是20世紀80年代末發(fā)展起來的一種研究基因功能的新型技術。此后經歷了將近20年的推廣和應用,直到2007年10月8日,美國科學家Capecchi和OliverSmithies、英國科學家Evans因為在利用胚胎干細胞對小鼠基因進行定向修飾原理方面的系列發(fā)現(xiàn)分享了2007年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎,基因打靶技術才獲得諾貝爾獎評審委員會的關注和肯定。早在1973年,Mishra等首次報道了絲狀真菌粗糙鏈孢霉(Neurosporacrassa)的DNA轉化現(xiàn)象,他們用野生型菌株的總DNA處理肌醇缺陷型菌株,獲得了肌醇原養(yǎng)型轉化菌株,但受到質疑;因為在當時普遍認為真核生物發(fā)生轉化幾乎是不可能的,上述實驗的結果有可能是由于回復突變造成的。Mishra改進了設計,用含有溫度敏感肌醇等位基因突變菌株的DNA來處理肌醇缺陷型菌株,得到了溫度敏感轉化菌株。隨后,Case等證實DNA介導的粗糙鏈孢霉遺傳轉化,在轉化子中含有整合于染色體上的質粒DNA片段。此后據(jù)不完全統(tǒng)計,已有超過100種絲狀真菌實現(xiàn)了轉化(表1)[20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31]。2關于絲狀真菌基因的提取技術的研究2.1基因缺失修飾基因敲除(Geneknockout)又稱基因打靶(Genetargeting),是對序列已知但功能未知的基因,從分子水平上設計實驗,將該基因去除或用其它順序相近的基因取代,根據(jù)宿主的形態(tài)、生理生化特性等的變化來推測相應基因的功能。絕大多數(shù)的基因敲除策略都是基于同源重組(Homologousrecombination,HR)機制。利用此技術可以在分子水平上將目標基因進行定向修飾,包括基因失活、引入點突變、缺失突變和插入外源片段等,并可將修飾后的遺傳信息在生物體內表達,從而通過表型的變化揭示目標基因的功能。目前已有多種真菌構建了含豐富類型轉化子的突變體庫。2.2同源序列雙交換現(xiàn)象通過同源重組(HR)整合外源基因的效率在不同種甚至不同菌種之間是不同的。目標整合依賴于目標基因兩端與選擇標記基因兩端的同源序列之間雙交換(圖1)?；蛲粗亟M現(xiàn)象首次在哺乳動物細胞中證實存在,這為基因敲除技術的創(chuàng)立奠定了理論基礎。之后近20年來,此技術已經由在酵母和哺乳動物中的應用,拓展到了植物、真菌基因功能研究中,主要包括敲除載體構建、敲除載體的真菌轉化、轉化子篩選和目的敲除轉化子鑒定等。2.2.1in-sfson克隆技術敲除載體由四部分組成,包括與靶序列兩端同源的同源臂序列(HRS1和HRS2),中間的篩選標記基因序列以及載體序列。大多數(shù)已報道的對目的基因進行研究的方法都基于傳統(tǒng)的克隆策略來構建敲除載體,包括體外轉座子突變、酶切連接、FusionPCR、Split-marker-basedATMT等方法。在利用這些方法構建敲除載體的過程中,由于需要多步克隆,或者受酶切位點的限制等因素,構建載體費時費力。隨著生物學的發(fā)展,對于重組片段的組合,形成了多種新型技術,克隆只需一步完成,主要包括In-Fusion克隆技術和USER(Uracilspecificexcisionreagent)克隆技術。In-Fusion依賴于In-Fusion酶3′-5′外切酶活性,關鍵技術就是在進行PCR兩端引物設計時,在目的基因同源序列的兩側分別加入與線性化載體兩端相同的堿基各10~15個,這樣經過Polymerasechainreaction(PCR)得到的產物兩端就分別帶上了10~15個和載體末端重復的序列,加入In-Fusion酶后就可以實現(xiàn)類似同源重組的反應,將PCR產物“置換”到目標載體上。該方法不需要借助任何限制性內切酶、連接酶,或者磷酸化、補平末端等手段,就可以將任何PCR產物片段精確定向克隆到目的載體上,并且克隆的位置不受酶切位點的限制。另外,該方法對載體沒有特別的要求,任何自備的載體都可以使用。另一種技術USER克隆對載體則有特殊的要求。USER體系依賴于USER酶,是一種特異性切割尿嘧啶的酶,是尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和核酸內切酶VIII(一種DNA糖基化酶-裂解酶)的混合物。UDG催化尿嘧啶堿基的切除,形成一個脫堿基(脫嘧啶)位點,但同時保持了磷酸二酯鍵骨架的完整性。核酸內切酶VIII的裂解酶活性則分別在脫堿基位點的3′端和5′端裂解磷酸二酯鍵骨架,釋放五堿基的脫氧核糖。磷酸二酯鍵斷裂后,DNA兩端形成3′突出端,即USER克隆位點(USERcloningsites,UCSs)。當將載體與經過USER酶處理過的PCR片段混合時,便會組裝成一個重組分子。相對In-Fusion方法,USER克隆整合效率要高很多,大概為80%(而In-Fusion整合效率為10%~20%)。2.2.2受體材料的選擇絲狀真菌的DNA轉化方法主要有原生質體轉化、基因槍轉化、限制酶介導的遺傳轉化和根癌農桿菌介導的轉化法等。其中農桿菌介導遺傳轉化具有受體材料范圍廣、轉化效率高、轉化子能夠穩(wěn)定遺傳、DNA多為單拷貝插入等不可比擬的優(yōu)點,因此在絲狀真菌研究中應用較為廣泛。周芳芳等利用農桿菌介導轉化(ATMT)的方法,構建了含2000個轉化子的棉花黃萎病菌強毒菌株Vd080的突變體庫,并對轉化體系進行了優(yōu)化;研究證實,200μmol·L-1的誘導劑乙酰丁香酮(AS),25℃共培養(yǎng)48h,轉化效率達每106個孢子有150~540個轉化子。2.2.3同源重組的檢測在基因敲除過程中,轉化子篩選是一個技術難點。雖然借助農桿菌介導的遺傳轉化極大地提高了轉化效率,但是由于T-DNA自身的性質,它會隨機整合到基因組中,造成T-DNA隨機插入轉化子和同源雙交換產生的基因敲除轉化子都帶有同樣的選擇標記而難以區(qū)分。而且等位基因同源重組的效率相對T-DNA隨機插入的效率低很多,造成基因敲除轉化子的數(shù)量遠遠少于隨機插入的轉化子,往往需要篩選大量轉化子才能得到基因敲除的轉化子。通過基因重組進行基因敲除要求已知靶基因兩端的側翼序列,但不同生物中所要求的側翼序列長度不同。在釀酒酵母和裂殖酵母中,同源序列為50~100bp即可實現(xiàn)同源位點的基因替換,同源重組效率可達到50%~100%;而絲狀真菌通常需要1kb甚至更長的同源序列,重組效率才能達到10%~30%。而且,絲狀真菌中靶序列與載體上所帶序列的相似性需接近100%。不同菌株相似序列內些許變化都可能造成同源重組失敗。Maier等研究了同源序列長度對尖孢鐮孢菌轉化和同源重組率的影響,結果顯示,當同源序列長度為800bp時,同源重組率可達到93%以上;同源長度為500bp時,同源重組率為70%;而當同源片段長度小于400bp時,同源重組率還不到10%。因此在構建敲除載體時需根據(jù)不同的菌株選擇合適的同源片段的長度。隨機插入和同源重組轉化子都含有抗性基因,是轉化子篩選的難題。為解決該問題,現(xiàn)在研究人員在敲除載體中加入特殊的結構元件或采用特殊的報告基因來提高篩選效率。田李等在農桿菌T-DNA之間除了加入同源重組DNA片段,還加入了致死基因單純皰疹病毒胸苷激酶(Herpessimplexvirusthymidinekinase,HSVtk),該致死基因可以使T-DNA轉化子不能存活,反過來即提高基因敲除轉化子的比例,成功構建了敲除載體Pko-ADE4和Pko-chsv,基因敲除轉化子的比例分別達到了87%和44%,大大提高了目的敲除轉化子的比例。Mansour等在小鼠胚胎肝細胞進行基因敲除試驗中首先采用了正負篩選策略,正選擇標記可以篩選出發(fā)生重組的轉化子,負選擇標記排除發(fā)生非同源重組的轉化子。Takahashi等將這種方法用于醬油曲霉,由此推測這一技術也適用于其它絲狀真菌。Maier等以失活聚酮合酶基因PKS12為選擇標記基因,由于失活的pks12基因的菌株會發(fā)生白化現(xiàn)象,建立了禾谷鐮刀菌的高效敲除體系,同源重組率可達到93%以上。在轉化過程中,外源基因整合到受體染色體上時,主要有兩種重組途徑涉及到雙鏈DNA破壞修復(DSBs),即同源重組(HR)途徑和非同源末端連接(Nonhomologousendjoining,NHEJ)途徑。前者主要依賴于同源片段,后者不需要同源片段即可整合到宿主細胞染色體上。另外,在人類細胞中,NHEJ途徑受特異蛋白因子如DNA依賴型蛋白激酶、Ku70、Ku80以及DNA連接酶IV-Xrcc4復合物的影響,這些影響因子在真菌和人類細胞中相對保守。因此一種解決重組效率低的方法是構建失活NHEJ菌株。有報道稱,Ku70缺失菌株同源重組率幾乎接近100%。然而,JieFeng等構建了葉枯病菌穎枯殼針孢Ku70缺失菌株,并證實與野生型相比,缺失菌株同源重組率顯著提高,但并不像先前報道的那么高。FangZhe等構建了ligD缺失突變體,證明同源重組率由原來的不到2%上升到85%。但總體來說,構建NHEJ缺失菌株確實比野生型菌株同源重組率高。綜上所述,對目的敲除轉化子進行篩選主要有以下幾種方法,常規(guī)的同源重組交換(即不需要對受體菌及載體做任何特殊的處理),對受體菌進行改造(即將敲除掉KU70/KU80等阻斷NHEJ途徑的基因的內生真菌作為受體菌),敲除載體中加入致死基因(即在敲除載體中加入1個致死基因,如HSVtk,來提高篩選率)和表型篩選(即敲掉某表達表型的基因后,通過表型的變化來對轉化子進行篩選)。從表2可以明顯看出,其它3種方法都要比常規(guī)的HR方法重組率要高得多,對于采用哪種方法最好,并沒有絕對的說法,研究者需根據(jù)內生真菌的性質以及敲除基因的表型等進行選擇。2.2.4轉化子的確定3基因功能研究在絲狀真菌研究中,功能驗證的研究方法各有優(yōu)缺點,基因敲除是以同源重組為理論基礎的先進的轉基因技術,具有整合位點單一、精確等優(yōu)點。但是基因敲除可能導致某基因功能的缺失,但生物體可能存在某些代謝補償途徑,使敲除表型被掩蓋或發(fā)生變化,因此,僅僅從最后表型判斷有時并不能從本質上揭示某基因的功能。任何一種基因功能研究方法可能在某一個體系效果較好,在另一個體系較差。采取哪一種方法主要取決于實踐經驗、不同物種及研究目標,因此要全面系統(tǒng)地研究某一基因的功能,通常需要嘗試應用多種技術體系。越來越多的絲狀真菌測序的完成及現(xiàn)代分子生物學手段的快速發(fā)展,基因功能的研究逐漸成為研究熱點,研究者在工作中,改進和發(fā)展了多種高效敲除基因的手段。相信在不久的將來,農桿菌介導的遺傳轉化基因敲除技術廣泛使用,對基因功能的研究將會變得更加快速全面高效。對轉化子的鑒定,通常使用的方法有分子鑒定和表型觀測。分子鑒定是使用選擇標記基因引物和目標基因引物擴增來驗證轉化子或者以目標基因為探針進行Southern雜交來鑒定轉化子。表型驗證是觀察野生型與突變體表型,或者構建互補載體,得到互補突變體,觀察野生型和互補突變體表型最終驗證目標基因的功能。田李等構建了ADE4(腺嘌呤合成酶基因)和ChsV(幾丁質合成酶基因)敲除突變體,采用分子生物學證據(jù),即分別以野生型菌株和轉化子菌株基因組為模板,潮霉素抗性基因HPH引物和目的基因引物同時PCR擴增,結果表明野生型只能擴出目的基因一條帶,陽性轉化子只能擴出HPH一條帶,而非陽性轉化子則可以同時擴出HPH和