HIV實(shí)驗(yàn)室診斷文檔

測(cè)是艾滋病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中最常用的方法，因?yàn)镠IV抗體是患者感染HIV后最容易檢出并且本的認(rèn)識(shí)。實(shí)驗(yàn)室工作人員應(yīng)特別注意病毒的結(jié)構(gòu)、抗原組成，人體的免疫反應(yīng)，診斷試驗(yàn)的基本原理、試驗(yàn)結(jié)果的解釋，以及為了準(zhǔn)措施。如果由于缺乏技術(shù)專長(zhǎng)或基本知識(shí)而造成不正確的試驗(yàn)結(jié)果是不可原諒的。現(xiàn)將有年份美國(guó)首先在洛杉磯男性同性戀中發(fā)現(xiàn)5例以往很罕見(jiàn)的卡氏肺囊蟲(chóng)肺炎和26例卡波濟(jì)氏肉瘤患者，這些病人均表現(xiàn)有嚴(yán)重的免疫缺陷，但原因不明。1982年將這種新的疾病命名為"獲得性免疫缺陷綜合征"Syndrome,AIDS,即艾滋病從艾滋病流行學(xué)資料分析很可能是由病毒引起的。法國(guó)巴斯德研究所Montagnier等首先從多發(fā)性淋巴結(jié)病綜合癥病人分離到一種新的逆轉(zhuǎn)錄病毒淋巴結(jié)病相關(guān)病毒美國(guó)國(guó)立癌癥研究所RobertGallo等報(bào)道從艾滋病病人活檢組織分離到一種新的逆轉(zhuǎn)錄病毒與其以前發(fā)現(xiàn)的HTLV-1和HTLV-Ⅱ不同。人類嗜T淋巴細(xì)胞Ⅲ型病毒typeⅢ,HTLV-Ⅲ美國(guó)加州大學(xué)分離出艾滋病相關(guān)病毒年份國(guó)際病毒分類委員會(huì)將上述病毒統(tǒng)一命名為人類免疫缺陷病毒Montagnier等又從西非病人體內(nèi)分離出一種具有相似生物學(xué)特性，而致病性、抗原性及分子生物學(xué)特征有明顯差別的新病毒，新發(fā)現(xiàn)的病毒命名為HIV-2,原來(lái)發(fā)現(xiàn)且已廣泛流行的HIV稱HIV-1。也至少有6個(gè)亞型(A-F)。在我國(guó)流行的是HIV-1,檢測(cè)到的亞型有8種之多，其中B亞HIV病毒呈球形或卵圓形顆粒，直徑100-140mm,具有包膜。包膜是在病毒出芽釋放HIV-2的跨膜蛋白抗原稱為gp36,而某些人則稱之為gp41,又如主但在HIV-2又稱P26。機(jī)體感染HIV后，HIV能夠侵襲許多帶有CD?表面抗原的細(xì)胞(稱CD?+細(xì)胞),主要有由于感染HIV,細(xì)胞表面表達(dá)大量包膜糖蛋白，可以與周圍細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞膜融合，形成多核巨細(xì)胞。通過(guò)這種方式在細(xì)胞間播散病毒，可免受抗體的作用。HIV感染引起T?細(xì)胞明顯減少的機(jī)理主要由于：1、HIV直接殺傷T?細(xì)胞；2、細(xì)胞融合間接地?fù)p傷T?細(xì)胞；3、HIV感染T?細(xì)胞，發(fā)生抗原性變化，引起自身免疫，通過(guò)調(diào)理吞噬作用損作T?細(xì)胞，T?細(xì)胞表面表達(dá)gpl20位點(diǎn)處吸著特異性抗體，通過(guò)抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)損傷T?細(xì)胞。另外，由于T4細(xì)胞免疫功能損傷，B細(xì)胞對(duì)各種抗原產(chǎn)生抗體的功能也受到影響，使整個(gè)機(jī)體免疫功能嚴(yán)重破壞，導(dǎo)致各種機(jī)會(huì)性感染性疾病的發(fā)生。T?細(xì)胞計(jì)數(shù)是反映臨床癥狀的敏感信息，因此T?淋巴細(xì)胞總數(shù)<200/mm3是診斷AIDS的重要指標(biāo)。人體能對(duì)HIV的侵入產(chǎn)生抗體應(yīng)答，通常是在HIV感染2-10周內(nèi)機(jī)體產(chǎn)生抗體。但也有極少數(shù)人感染數(shù)月乃至數(shù)年后仍測(cè)不出抗體，故陰性結(jié)果并不說(shuō)明受檢者絕無(wú)感染。絕大多數(shù)人在感染過(guò)程中都會(huì)對(duì)各種病毒抗原成份產(chǎn)生免疫應(yīng)答，抗體滴度可高達(dá)1:50000,但也可以很低。感染早期(血清陽(yáng)轉(zhuǎn)時(shí))及病程后期(免疫缺陷)時(shí)，抗體滴度均較低。低滴度抗體血清學(xué)反應(yīng)較弱，如果測(cè)定方法不夠靈敏，可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果。值得注意的是，并非每個(gè)HIV感染者對(duì)其所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答都完全相同。如某些人可能對(duì)P24有較強(qiáng)的應(yīng)答。如果檢測(cè)試劑主要是測(cè)定抗gp41的抗體，它就不太可能對(duì)僅有抗P24和gp120抗體的血清得出陽(yáng)性結(jié)果?？筭ag蛋白(P55、P24)抗體通常在感染早期即出現(xiàn)，抗env和pol產(chǎn)物的抗體同時(shí)或稍后產(chǎn)生。感染后至抗體出現(xiàn)前有段間歇期(2-6周，可長(zhǎng)至3個(gè)月)大多數(shù)病毒感染者都有IgM抗體產(chǎn)生，但HIV感染者中似乎不完全有IgM應(yīng)答。對(duì)于有IgM抗體應(yīng)答者，在窗口期檢出IgM抗體是有益的。HIV基因組可整合到宿主細(xì)胞DNA上使機(jī)體終身帶有病毒，但機(jī)體可能很多年不出現(xiàn)癥狀，成為HIV無(wú)癥狀感染者，只是查血時(shí)發(fā)現(xiàn)抗一HIV陽(yáng)性。爾后，在某些因素作用下，病毒被激活后并開(kāi)始大量復(fù)制出現(xiàn)癥狀和各種合并癥，則發(fā)展成艾滋病病人，HIV病毒很容易發(fā)生變異這是研制有效疫苗的主要困難之一。人體感染HIV后，血液中最先出現(xiàn)HIV抗原，然后很快消失直到疾病后期才重新出現(xiàn)。室診斷以抗體檢測(cè)為主，病毒及相關(guān)抗原的檢測(cè)為輔?？贵w檢測(cè)分為初篩試驗(yàn)和確證試驗(yàn)兩種，初篩試驗(yàn)為陽(yáng)性的血清必須進(jìn)一步確證，確證為陽(yáng)性的方可報(bào)告為HIV感染陽(yáng)性。多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)主要用于檢測(cè)血漿中HIV的RNA含量，目前主要用于預(yù)測(cè)母親將HIV傳染給胎兒的可能性以及新生兒的HIV感染狀況。此外，尚可用于判斷病人的預(yù)后及監(jiān)測(cè)抗病毒治療的效果。(一)標(biāo)本收集相對(duì)來(lái)說(shuō)，對(duì)特異性要求不是太嚴(yán)，允許有少量假陽(yáng)性，這些假陽(yáng)性可以通過(guò)重復(fù)試驗(yàn)和等。這些實(shí)驗(yàn)使用的抗原早期是完整病毒的裂解產(chǎn)物，稱為第一代試劑，這種抗原常常由于含有宿主細(xì)胞的成分而出現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)，為了獲得可接受的特異性而稀釋標(biāo)本使試劑的敏感性也有所下降，同時(shí)這種抗原制備和純化都比較困難，危險(xiǎn)性大。第二代試劑使用重這類抗原制備也更為安全、容易、重復(fù)性好。應(yīng)該注意的是重組抗原有時(shí)由于含有載體的組分而出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，多肽抗原由于缺乏合適的立體構(gòu)象有可能使敏感性下降從而導(dǎo)致假陰性。使用重組或合成多肽抗原制備的雙抗原夾心法試劑盒常常被稱為第三代試劑，這種試劑可以檢測(cè)針對(duì)HIV抗原的所有抗體亞類，包括IgG、IgA、IgM、IgE、IgD,同時(shí)不需要將標(biāo)本過(guò)度稀釋來(lái)保證特異性，因而具有較高的敏感性。第四代試劑除使用重組或合它具有準(zhǔn)確性高、價(jià)格低廉、判斷結(jié)果有客觀標(biāo)準(zhǔn)、結(jié)果便于記錄和保存等優(yōu)點(diǎn)，適合于(1)方法和原理：使用最多的ELISA方法是間接法，這種方法的原理是將HIV抗原體結(jié)合，形成HIV抗原-HIV抗體-酶標(biāo)記的抗人免疫球蛋白抗體復(fù)合物，最后加入底物-HIV抗體-酶標(biāo)記HIV抗原復(fù)合物，最后加入底物發(fā)生酶催化的顯色反應(yīng)，測(cè)定光密度標(biāo)記HIV抗體，如標(biāo)本中的抗體濃度高，酶標(biāo)記HIV抗體就不能HIV的酶標(biāo)記HIV抗體將與固相載體上的HIV抗光密度值與標(biāo)本中的抗體含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。這種方法是將標(biāo)本與酶標(biāo)抗體同時(shí)加入，需將檢測(cè)的陽(yáng)性和(或)陰性對(duì)照的OD值代入廠商提供的計(jì)算公式計(jì)算出來(lái)的判斷陽(yáng)性和性結(jié)果的界值。對(duì)于間接法和雙抗原夾心法，標(biāo)本OD值與臨界值的比值大于等于1(S/CO>1)為陽(yáng)性；對(duì)于競(jìng)爭(zhēng)法，標(biāo)本OD值與臨界值的比值小于等于1(S/CO≤1)為陽(yáng)性。體，它們將與孔中的抗原結(jié)合。標(biāo)本緩沖液用來(lái)減低孔中其它蛋白及抗體對(duì)孔壁的非特異強(qiáng)度與標(biāo)本中抗體含量成正比。反應(yīng)用EDTA終止，用酶標(biāo)儀在405nm處測(cè)吸收峰而讀取(1)方法和原理(2)結(jié)果判定②1:8血清稀釋孔加25μ1非致敏粒子，1:16血清稀釋孔加25μ1致敏粒子。明膠顆粒凝集試驗(yàn)22稀釋度3(三)、確證(確認(rèn))試驗(yàn)a、膜條沒(méi)有條帶出現(xiàn)表示陰性(一)表示(+).(四)檢驗(yàn)程度第一次檢測(cè)第2次檢測(cè)結(jié)果判定單分子或每10萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中僅含1個(gè)DNA分子的樣品。它是一種選擇性體外擴(kuò)增DNA或合成的新模板；因此，第二循環(huán)后延伸的模板由第一循環(huán)的4條增為8條，依此類推，以后每一個(gè)循環(huán)后的模板均比前一個(gè)循環(huán)增加1倍。理論上講PCR擴(kuò)增DNA產(chǎn)量是呈指數(shù)上升的。PCR技術(shù)具有特異性強(qiáng)、敏感性高、快速、簡(jiǎn)便、對(duì)起始材料質(zhì)量要求低等特PCR用于檢測(cè)HIV的優(yōu)點(diǎn)如下：1.與傳統(tǒng)檢測(cè)抗體的方法相比，其靈敏度和特異性更高，從而對(duì)HIV的定量檢測(cè)提供了有效的手段；2.不依賴于宿主的免疫反應(yīng)，無(wú)須等到免疫系統(tǒng)對(duì)HIV產(chǎn)生抗體后才能檢定宿主受HIV感染的狀態(tài)，這有利于對(duì)血清陽(yáng)轉(zhuǎn)以前標(biāo)本的檢測(cè)和對(duì)陽(yáng)性母親所生嬰兒的HIV感染的調(diào)查；3.對(duì)潛伏狀態(tài)的HIV的檢測(cè)不依賴于HIV在宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)活性。綜上所述，PCR是對(duì)HIV核酸檢測(cè)的有效手段，是對(duì)HIV病毒分離、血清學(xué)抗體檢測(cè)方法的必要補(bǔ)充。在HIV感染的確診和艾滋病診斷中，核酸的檢測(cè)對(duì)病原活動(dòng)的監(jiān)控更加有效方便，因?yàn)楹怂釓?fù)制的有無(wú)和數(shù)量是體內(nèi)病毒復(fù)制情況的直接反映。多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)主要用于檢測(cè)血漿中HIV的RNA含量，目前主要用于預(yù)測(cè)母親將HIV傳染給胎兒的可能性以及新生兒的HIV感染狀況。此外，尚可用于判斷病人的預(yù)后及監(jiān)測(cè)抗病毒治療的效果。四、艾滋病病原學(xué)診斷中的幾個(gè)問(wèn)題。實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)的陽(yáng)性結(jié)果，應(yīng)再次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，若仍為陽(yáng)性，則應(yīng)用確證實(shí)驗(yàn)去證實(shí)，只有確證和HIV-2,兩型病毒間只有少部分抗原有交叉(主要是Gag基因編碼的核蛋白)。因而各型病毒試劑只能有效地檢測(cè)出同型病毒的抗體。法均無(wú)法查到病毒的存在，2周后出現(xiàn)病毒血癥，此時(shí)可用抗原檢測(cè)方法、檢查病毒抗原或測(cè)定病毒逆轉(zhuǎn)錄酶活性，而不能用血清學(xué)方法，因?yàn)榭贵w要到感染后6-8周才會(huì)出現(xiàn)。此后就只能用抗體檢測(cè)方法，直到艾滋病的出現(xiàn)，因?yàn)樵谶@段時(shí)間HIV抗原很難從血清中查到，待發(fā)展到艾滋病階段時(shí)才會(huì)重新出現(xiàn)。3、HIV抗體測(cè)定的靈敏度、特異度和預(yù)測(cè)值：檢驗(yàn)結(jié)果抗體情況總計(jì)陽(yáng)性有真的陽(yáng)性(a)假的無(wú)假的陽(yáng)性(b)真的所有陽(yáng)性試驗(yàn)(a+b)所有陰性陰性陰性(c)都有抗體陰性(d)都無(wú)抗體試驗(yàn)(c+d) 敏感性：是指在有抗體存在的標(biāo)本中，檢出抗體的準(zhǔn)確性。敏感性低的試驗(yàn)將有許多假特異性：是指在沒(méi)有抗體存在的標(biāo)本中，檢測(cè)其抗體缺失的準(zhǔn)確性。特異度低的試驗(yàn)將理想的是，一種試驗(yàn)應(yīng)當(dāng)具有100%的敏感性和100%的特異性。但實(shí)際上，沒(méi)有一種都在99%以上。除非由于檢驗(yàn)人員造成人為誤差，這種檢驗(yàn)方法所固有的特性是不會(huì)出現(xiàn)試劑的敏感性和特異性可以衡量它的優(yōu)劣，但并不能決定一個(gè)測(cè)定結(jié)果正確與否的可陰性的結(jié)果是真陽(yáng)性或真陰性的可能性。這除與所用試劑的優(yōu)劣有關(guān)外，還取決于測(cè)定對(duì)戀人群可高達(dá)99.88%,而對(duì)正常人則為18.94%,反之，一個(gè)陰性結(jié)果的真實(shí)性對(duì)前者不足90%,而對(duì)后者則高達(dá)99.997%。表2ELISA法HIV-1抗體測(cè)定的預(yù)測(cè)值舊金山同性戀人群美國(guó)非高危人群等確定實(shí)驗(yàn)證實(shí)后方可報(bào)告。相反，對(duì)來(lái)自疫區(qū)的外國(guó)人或在疫區(qū)長(zhǎng)期居住的歸國(guó)人員可許多HIV抗體檢測(cè)方法除了是一種定性實(shí)驗(yàn)外，還同時(shí)是一種半定量實(shí)驗(yàn)。這例如，表3中的HIV感染率為30/10萬(wàn)的正常獻(xiàn)血員，中等強(qiáng)度反應(yīng)時(shí)，HIV抗體陽(yáng)性概率僅為1.13%,而在高強(qiáng)度反應(yīng)時(shí)該概率則激增到86.1%,與同樣強(qiáng)度的來(lái)自HIV感染率極高的吸毒人群(45000/10萬(wàn))的概率相近。表3HIV感染機(jī)率與ELISA反應(yīng)強(qiáng)度的關(guān)系ELISA反應(yīng)強(qiáng)度(%)(/10萬(wàn))非高危獻(xiàn)血員高危獻(xiàn)血吸毒者注：(1)數(shù)字表示相應(yīng)強(qiáng)度反