hiv實(shí)驗(yàn)室診斷文檔

測是艾滋病實(shí)驗(yàn)室檢測中最常用的方法，因?yàn)镠IV抗體是患者感染HIV后最容易檢出并且本的認(rèn)識(shí)。實(shí)驗(yàn)室工作人員應(yīng)特別注意病毒的結(jié)構(gòu)、抗原組成，人體的免疫反應(yīng)，診斷試驗(yàn)的基本原理、試驗(yàn)結(jié)果的解釋，以及為了準(zhǔn)措施。如果由于缺乏技術(shù)專長或基本知識(shí)而造成不正確的試驗(yàn)結(jié)果是不可原諒的?，F(xiàn)將有年份美國首先在洛杉磯男性同性戀中發(fā)現(xiàn)5例以往很罕見的卡氏肺囊蟲肺炎和26例卡波濟(jì)氏肉瘤患者，這些病人均表現(xiàn)有嚴(yán)重的免疫缺陷，但原因不明。1982年將這種新的疾病命名為"獲得性免疫缺陷綜合征"Syndrome,AIDS,即艾滋病從艾滋病流行學(xué)資料分析很可能是由病毒引起的。法國巴斯德研究所Montagnier等首先從多發(fā)性淋巴結(jié)病綜合癥病人分離到一種新的逆轉(zhuǎn)錄病毒淋巴結(jié)病相關(guān)病毒美國國立癌癥研究所RobertGallo等報(bào)道從艾滋病病人活檢組織分離到一種新的逆轉(zhuǎn)錄病毒與其以前發(fā)現(xiàn)的HTLV-1和HTLV-Ⅱ不同。人類嗜T淋巴細(xì)胞Ⅲ型病毒typeⅢ,HTLV-Ⅲ美國加州大學(xué)分離出艾滋病相關(guān)病毒2年份國際病毒分類委員會(huì)將上述病毒統(tǒng)一命名為人類免疫缺陷病毒Montagnier等又從西非病人體內(nèi)分離出一種具有相似生物學(xué)特性，而致病性、抗原性及分子生物學(xué)特征有明顯差別的新病毒。新發(fā)現(xiàn)的病毒命名為HIV-2,原來發(fā)現(xiàn)且已廣泛流行的HIV稱HIV-1。也至少有6個(gè)亞型(A-F)。在我國流行的是HIV-1,檢測到的亞型有8種之多，其中B亞HIV病毒呈球形或卵圓形顆粒，直徑100-140mm,具有包膜。包膜是在病毒出芽釋放1、gag蛋白：位于病毒顆粒內(nèi)核心部位，主要有分子量為55000道爾頓的蛋白質(zhì)(P),HIV-2的跨膜蛋白抗原稱為gp36,而某些人則稱之為gp41,又如主但在HIV-2又稱P26。3機(jī)體感染HIV后，HIV能夠侵襲許多帶有CD?表面抗原的細(xì)胞(稱CD?+細(xì)胞),主要有由于感染HIV,細(xì)胞表面表達(dá)大量包膜糖蛋白，可以與周圍細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞膜融合，形成多核巨細(xì)胞。通過這種方式在細(xì)胞間播散病毒，可免受抗體的作用。HIV感染引起T?細(xì)胞明顯減少的機(jī)理主要由于：1、HIV直接殺傷T?細(xì)胞；2、細(xì)胞融合間接地?fù)p傷T?細(xì)胞；3、HIV感染T?細(xì)胞，發(fā)生抗原性變化，引起自身免疫，通過調(diào)理吞噬作用損作T?細(xì)胞，T?細(xì)胞表面表達(dá)gpl20位點(diǎn)處吸著特異性抗體，通過抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)損傷T?細(xì)胞。另外，由于T4細(xì)胞免疫功能損傷，B細(xì)胞對各種抗原產(chǎn)生抗體的功能也受到影響，使整個(gè)機(jī)體免疫功能嚴(yán)重破壞，導(dǎo)致各種機(jī)會(huì)性感染性疾病的發(fā)生。T?細(xì)胞計(jì)數(shù)是反映臨床癥狀的敏感信息，因此T?淋巴細(xì)胞總數(shù)<200/mm3是診斷AIDS的重要指標(biāo)。人體能對HIV的侵入產(chǎn)生抗體應(yīng)答，通常是在HIV感染2-10周內(nèi)機(jī)體產(chǎn)生抗體。但也有極少數(shù)人感染數(shù)月乃至數(shù)年后仍測不出抗體，故陰性結(jié)果并不說明受檢者絕無感染。絕大多數(shù)人在感染過程中都會(huì)對各種病毒抗原成份產(chǎn)生免疫應(yīng)答，抗體滴度可高達(dá)1:50000,但也可以很低。感染早期(血清陽轉(zhuǎn)時(shí))及病程后期(免疫缺陷)時(shí)，抗體滴度均較低。低滴度抗體血清學(xué)反應(yīng)較弱，如果測定方法不夠靈敏，可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果。值得注意的是，并非每個(gè)HIV感染者對其所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答都完全相同。如某些人可能對P24有較強(qiáng)的應(yīng)答。如果檢測試劑主要是測定抗gp41的抗體，它就不太可能對僅有抗P24和gp120抗體的血清得出陽性結(jié)果。抗gag蛋白(P55、P24)抗體通常在感染早期即出現(xiàn)，抗env和pol產(chǎn)物的抗體同時(shí)或稍后產(chǎn)生。感染后至抗體出現(xiàn)前有段間歇期(2-6周，可長至3個(gè)月)大多數(shù)病毒感染者都有IgM抗體產(chǎn)生，但HIV感染者中似乎不完全有IgM應(yīng)答。對于有IgM抗體應(yīng)答者，在窗口期檢出IgM抗體是有益的。HIV基因組可整合到宿主細(xì)胞DNA上使機(jī)體終身帶有病毒，但機(jī)體可能很多年不出現(xiàn)癥狀，成為HIV無癥狀感染者，只是查血時(shí)發(fā)現(xiàn)抗一HIV陽性。爾后，在某些因素作用下，病毒被激活后并開始大量復(fù)制出現(xiàn)癥狀和各種合并癥，則發(fā)展成艾滋病病人，HIV病毒很容易發(fā)生變異這是研制有效疫苗的主要困難之一。人體感染HIV后，血液中最先出現(xiàn)HIV抗原，然后很快消失直到疾病后期才重新出現(xiàn)。室診斷以抗體檢測為主，病毒及相關(guān)抗原的檢測為輔?？贵w檢測分為初篩試驗(yàn)和確證試驗(yàn)兩種，初篩試驗(yàn)為陽性的血清必須進(jìn)一步確證，確證為陽性的方可報(bào)告為HIV感染陽性。多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)主要用于檢測血漿中HIV的RNA含量，目前主要用于預(yù)測母親將HIV傳染給胎兒的可能性以及新生兒的HIV感染狀況。此外，尚可用于判斷病人的預(yù)后4(一)標(biāo)本收集用于檢測HIV抗原的血液樣本與檢測抗體的樣本的處理有所不同，根據(jù)需要，血液樣相對來說，對特異性要求不是太嚴(yán)，允許有少量假陽性，這些假陽性可以通過重復(fù)試驗(yàn)和等。這些實(shí)驗(yàn)使用的抗原早期是完整病毒的裂解產(chǎn)物，稱為第一代試劑，這種抗原常常由于含有宿主細(xì)胞的成分而出現(xiàn)假陽性反應(yīng)，為了獲得可接受的特異性而稀釋標(biāo)本使試劑的這類抗原制備也更為安全、容易、重復(fù)性好。應(yīng)該注意的是重組抗原有時(shí)由于含有載體的組分而出現(xiàn)假陽性結(jié)果，多肽抗原由于缺乏合適的立體構(gòu)象有可能使敏感性下降從而導(dǎo)致假陰性。使用重組或合成多肽抗原制備的雙抗原夾心法試劑盒常常被稱為第三代試劑，這種試劑可以檢測針對HIV抗原的所有抗體亞類，包括IgG、IgA、IgM、IgE、IgD,同時(shí)不需要將標(biāo)本過度稀釋來保證特異性，因而具有較高的敏感性。第四代試劑除使用重組或合它具有準(zhǔn)確性高、價(jià)格低廉、判斷結(jié)果有客觀標(biāo)準(zhǔn)、結(jié)果便于記錄和保存等優(yōu)點(diǎn)，適合于(1)方法和原理：使用最多的ELISA方法是間接法，這種方法的原理是將HIV抗原體結(jié)合，形成HIV抗原-HIV抗體-酶標(biāo)記的抗人免疫球蛋白抗體復(fù)合物，最后加入底物5-HIV抗體-酶標(biāo)記HIV抗原復(fù)合物，最后加入底物發(fā)生酶催化的顯色反應(yīng)，測定光密度還有一種ELISA方法是競爭法。它的主要特點(diǎn)是酶標(biāo)記抗體是特異性的HIV抗體。標(biāo)的酶標(biāo)記HIV抗體將與固相載體上的HIV抗光密度值與標(biāo)本中的抗體含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。這種方法是將標(biāo)本與酶標(biāo)抗體同時(shí)加入，需將檢測的陽性和(或)陰性對照的OD值代入廠商提供的計(jì)算公式計(jì)算出來的判斷陽性和性結(jié)果的界值。對于間接法和雙抗原夾心法，標(biāo)本OD值與臨界值的比值大于等于1(S/CO>1)為陽性；對于競爭法，標(biāo)本OD值與臨界值CO體，它們將與孔中的抗原結(jié)合。標(biāo)本緩沖液用來減低孔中其它蛋白及抗體對孔壁的非特異性結(jié)合。通過洗滌去除未結(jié)合的物質(zhì)。然后加入堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗人免疫球蛋白抗體強(qiáng)度與標(biāo)本中抗體含量成正比。反應(yīng)用EDTA終止，用酶標(biāo)儀在405nm處測吸收峰而讀取6試劑盒中包括陽性及陰性對照，每板應(yīng)做2個(gè)陽性對照及3個(gè)陰性對照，將陰性對照膠體金法檢測HIV抗體是一種不需要任何儀器設(shè)備的血清/血漿檢測法，它利用免疫層析分析原理來快速檢測血清/血漿中是否含有HIV抗體，從而用于判斷人體是否受到(1)方法和原理試劑盒采用高度特異性的抗體抗原反應(yīng)及免疫層析分析技術(shù)來定性檢測血清/血漿中中不含有HIV抗體，表明是陰性結(jié)果。無論HIV抗體是否存在于血清中，混合物都會(huì)繼續(xù)(2)結(jié)果判定陽性(+):兩條紅色帶出現(xiàn)。一條位于測試區(qū)內(nèi)(T),另一條位于質(zhì)控區(qū)內(nèi)(C)。陰性(-):僅質(zhì)控區(qū)(C)出現(xiàn)一條紅色條帶，在測試區(qū)內(nèi)(T)無紅色條帶出現(xiàn)。任何情況下，應(yīng)重新測試。如果問題仍然存在，應(yīng)立即停止使用此批號(hào)產(chǎn)品，并與當(dāng)?shù)毓?1)操作方法7①待測血清從1:4開始作倍比稀釋。②1:8血清稀釋孔加25μ1非致敏粒子，1:16血清稀釋孔加25μ1致敏粒子。③設(shè)置陽性對照血清，使其終末滴度為1:128。④振蕩混勻，加好蓋板，室溫(20℃)靜置2小時(shí)觀察結(jié)果①明膠顆粒沉積在孔底，周邊平滑，或形成致密圓圈為陰性結(jié)果；②孔底呈現(xiàn)均勻的凝集現(xiàn)象，或形成一個(gè)大的邊緣不整齊的圓圈，為陽性結(jié)果。標(biāo)本應(yīng)為新鮮標(biāo)本，無溶血。若標(biāo)本與致敏粒子、非致敏粒子均出現(xiàn)反應(yīng)，應(yīng)將標(biāo)本先和非致敏粒子吸附，然后再作檢測。123待檢血清血清稀釋液未致敏顆粒稀釋度孔號(hào)(三)、確證(確認(rèn))試驗(yàn)確證(確認(rèn))試驗(yàn)主要用蛋白印跡試驗(yàn)(WesternBlot,WB)。蛋白印跡法是將HIV病毒蛋白用十SDSPolyacrylamideGel的蛋白帶分離開來，然后再把這些已經(jīng)分離的不同蛋白帶電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上。將此膜切割成條狀，每一條硝酸纖維膜上均含有經(jīng)電泳分離過的HIV病毒抗原。將待檢血清樣品用稀釋液稀釋成1:100,再把它直接放到硝酸纖維膜上，并靜置一段時(shí)間，使其充分接觸反應(yīng)，血清中若含有HIV抗體，就會(huì)與硝酸纖維膜條上的抗原帶相結(jié)合。經(jīng)過沖洗去掉未結(jié)合的多余抗體，并加入抗人-IgG酶結(jié)合物，洗去未結(jié)合的抗人-IgG酶結(jié)合物，加入底或其它初篩檢測陽性后再用來確認(rèn)。a、膜條沒有條帶出現(xiàn)表示陰性(一)b、待檢標(biāo)本出現(xiàn)條帶的色度小于弱陽性對照gpl20帶色度時(shí)表示可疑(±)。c、待檢標(biāo)本出現(xiàn)的條帶色度相當(dāng)于弱陽性照gp120帶色度但比強(qiáng)陽性條帶的色度弱時(shí)表示(+).d、待檢標(biāo)本出現(xiàn)的條帶色度相當(dāng)于或大于強(qiáng)陽性對照gpl20帶色度時(shí)表示(++).8(四)檢驗(yàn)程度第一次檢測第2次檢測結(jié)果判定9合成的新模板；因此，第二循環(huán)后延伸的模板由第一循環(huán)的4條增為8條，依此類推，以后每一個(gè)循環(huán)后的模板均比前一個(gè)循環(huán)增加1倍。理論上講PCR擴(kuò)增DNA產(chǎn)量是呈指數(shù)上升的。PCR技術(shù)具有特異性強(qiáng)、敏感性高、快速、簡便、對起始材料質(zhì)量要求低等特PCR用于檢測HIV的優(yōu)點(diǎn)如下：1.與傳統(tǒng)檢測抗體的方法相比，其靈敏度和特異性更高，從而對HIV的定量檢測提供了有效的手段；2.不依賴于宿主的免疫反應(yīng)，無須等到免疫系統(tǒng)對HIV產(chǎn)生抗體后才能檢定宿主受HIV感染的狀態(tài)，這有利于對血清陽轉(zhuǎn)以前標(biāo)本的檢測和對陽性母親所生嬰兒的HIV感染的調(diào)查；3.對潛伏狀態(tài)的HIV的檢測不依賴于HIV在宿主細(xì)胞的生長活性。綜上所述，PCR是對HIV核酸檢測的有效手段，是對HIV病毒分離、血清學(xué)抗體檢測方法的必要補(bǔ)充。在HIV感染的確診和艾滋病診斷中，核酸的檢測對病原活動(dòng)的監(jiān)控更加有效方便，因?yàn)楹怂釓?fù)制的有無和數(shù)量是體內(nèi)病毒復(fù)制情況的直接反映。多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)主要用于檢測血漿中HIV的RNA含量，目前主要用于預(yù)測母親將HIV傳染給胎兒的可能性以及新生兒的HIV感染狀況。此外，尚可用于判斷病人的預(yù)后及監(jiān)測抗病毒治療的效果。實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)的陽性結(jié)果，應(yīng)再次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，若仍為陽性，則應(yīng)用確證實(shí)驗(yàn)去證實(shí)，只有確證和HIV-2,兩型病毒間只有少部分抗原有交叉(主要是Gag基因編碼的核蛋白)。因而各型病毒試劑只能有效地檢測出同型病毒的抗體。法均無法查到病毒的存在，2周后出現(xiàn)病毒血癥，此時(shí)可用抗原檢測方法、檢查病毒抗原或測定病毒逆轉(zhuǎn)錄酶活性，而不能用血清學(xué)方法，因?yàn)榭贵w要到感染后6-8周才會(huì)出現(xiàn)。此后就只能用抗體檢測方法，直到艾滋病的出現(xiàn)，因?yàn)樵谶@段時(shí)間HIV抗原很難從血清中查到，待發(fā)展到艾滋病階段時(shí)才會(huì)重新出現(xiàn)。3、HIV抗體測定的靈敏度、特異度和預(yù)測值：檢驗(yàn)結(jié)果抗體情況陽性有真的陽性(a)假的無假的陽性(b)真的所有陽性試驗(yàn)(a+b)所有陰性陰性陰性(c)都有抗體陰性(d)都無抗體試驗(yàn)(c+d)(a+b+c+d)敏感性：是指在有抗體存在的標(biāo)本中，檢出抗體的準(zhǔn)確性。敏感性低的試驗(yàn)將有許多假特異性：是指在沒有抗體存在的標(biāo)本中，檢測其抗體缺失的準(zhǔn)確性。特異度低的試驗(yàn)將特異性=d/b+d理想的是，一種試驗(yàn)應(yīng)當(dāng)具有100%的敏感性和100%的特異性。但實(shí)際上，沒有一種都在99%以上。除非由于檢驗(yàn)人員造成人為誤差，這種檢驗(yàn)方法所固有的特性是不會(huì)出現(xiàn)試劑的敏感性和特異性可以衡量它的優(yōu)劣，但并不能決定一個(gè)測定結(jié)果正確與否的可陰性的結(jié)果是真陽性或真陰性的可能性。這除與所用試劑的優(yōu)劣有關(guān)外，還取決于測定對戀