環(huán)境微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報告實(shí)驗(yàn)一到三

實(shí)驗(yàn)一

顯微鏡油鏡的使用和細(xì)菌形態(tài)的觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解顯微鏡的基本構(gòu)造和使用方法2、掌握油鏡的原理和使用方法3、了解細(xì)菌的三種基本形態(tài)二、顯微鏡的基本構(gòu)造三、油鏡使用的原理油鏡，即油浸物鏡。當(dāng)光線由反光鏡通過玻片與鏡頭之間的空氣時，由于空氣與玻片的密度不同，使光線受到曲折，發(fā)生散射，降低了視野的照明度。若中間的介質(zhì)是一層油（其折射率與玻片的相近），則幾乎不發(fā)生折射，增加了視野的進(jìn)光量和顯微鏡的分辨率從而使物象更加清晰。四、實(shí)驗(yàn)器材1、細(xì)菌三態(tài)裝片2、顯微鏡3、香柏油4、擦鏡紙等五、操作步驟1.放置好顯微鏡2.調(diào)節(jié)光源3.低倍鏡觀察4.高倍鏡觀察5.油鏡觀察6.清潔和還原顯微鏡顯微鏡觀察細(xì)菌涂片（細(xì)菌三型涂片、枯草桿菌涂片）使用油鏡：

低倍鏡（10×）高倍鏡（40×）油鏡（100×）1.放置好顯微鏡置顯微鏡于平穩(wěn)的實(shí)驗(yàn)臺上。鏡檢者姿勢要端正。（不論使用單筒顯微鏡或雙筒顯微鏡均應(yīng)雙眼同時睜開觀察，以減少眼睛疲勞，也便于邊觀察邊繪圖或記錄2.調(diào)節(jié)好光源接通電源，打開光源。3.低倍鏡的觀察觀察任何標(biāo)本都必須先用低倍鏡觀察，因?yàn)榈捅剁R視野范圍大，容易發(fā)現(xiàn)觀察目標(biāo)，確定觀察部位。將標(biāo)本片放在載物臺上，用標(biāo)本夾夾住，調(diào)節(jié)標(biāo)本移動螺旋，使觀察的目的物處于物鏡的正下方。調(diào)節(jié)粗調(diào)螺旋，使物鏡（10×）與標(biāo)本靠近，眼睛在測向注視物鏡，防止物鏡和載玻片相碰。張開雙眼向目鏡里觀察，如果見到目的物，但不十分清楚，可用細(xì)準(zhǔn)焦螺旋調(diào)節(jié)，至目的物清晰為止。通過玻片夾推進(jìn)器慢慢移動玻片，認(rèn)真觀察標(biāo)本各部分，找到合適的目的物，仔細(xì)觀察并記錄所觀察到的結(jié)果。4.高倍鏡的觀察（1）用低倍鏡找到標(biāo)本并調(diào)節(jié)清晰后，將欲放大的觀察部位用推進(jìn)器調(diào)到視野中央。（2）.旋動轉(zhuǎn)換器換高倍鏡。如果高倍鏡下觀察目的物有點(diǎn)模糊，調(diào)節(jié)細(xì)準(zhǔn)焦螺旋，直到視野清晰。調(diào)節(jié)細(xì)準(zhǔn)焦螺旋時要注意旋轉(zhuǎn)方向與載物臺上升或下降的關(guān)系，防止鏡頭與載玻片強(qiáng)力接觸，損壞鏡頭或載玻片。5.油鏡的觀察（1）如果用高倍鏡目的物未能看清，可用油鏡。先用低倍鏡和高倍鏡檢查標(biāo)本片，將目的物移到視野正中。下降載物臺，在載玻片上滴一滴香柏油，將油鏡移至正中，緩慢調(diào)節(jié)粗調(diào)螺（2）旋使油鏡頭浸沒在油中，剛好貼近載玻片。然后再用細(xì)準(zhǔn)焦螺旋微微向上調(diào)（切忌用粗準(zhǔn)焦螺旋）即可。（應(yīng)特別注意不要在升降載物臺時用力過猛，或者調(diào)焦時誤將粗調(diào)節(jié)螺旋向反方向轉(zhuǎn)動而損壞鏡頭及載玻片）6.清潔顯微鏡和還原顯微鏡.觀察結(jié)束后，調(diào)節(jié)光源到最小再關(guān)掉電源開關(guān)。調(diào)節(jié)粗調(diào)螺旋，使載物臺下降到最低，取下玻片。.把油鏡轉(zhuǎn)離光軸，擦鏡紙擦1～2次，去油，用二甲苯滴濕的擦鏡紙擦2次，再用擦鏡紙擦1～2次，順鏡頭直徑方向擦，不要圓周擦和來回擦。擦干凈鏡體，罩上防塵罩，然后放回原處。.用擦油鏡頭的方法擦玻片。六、顯微結(jié)構(gòu)圖的繪制

嚴(yán)格按光學(xué)顯微鏡的操作方法，依低倍、高倍及油鏡的次序觀察細(xì)菌裝片，并繪出其形態(tài)圖。生物繪圖中繪出的圖要清楚，并正確的表示出形態(tài)構(gòu)造的特點(diǎn)，繪圖注意事項(xiàng)如下：(1)繪圖要用黑色硬鉛筆，不要用軟鉛筆或有色鉛筆，一般用2H鉛筆為宜。(2)圖的大小及在紙上分布的位置要適當(dāng)。(3)畫圖時先用輕淡小點(diǎn)或輕線條畫出輪廓，再依照輪廓一筆畫出與物象相符的線條。線條要清晰，比例要準(zhǔn)確。(4)繪出的圖要正確，觀察時要把混雜物、破損、重疊等現(xiàn)象區(qū)別清楚，不要把這些現(xiàn)象繪上。(5)圖的明暗及濃淡，應(yīng)用細(xì)點(diǎn)表示，不要采用涂抹方法。點(diǎn)細(xì)點(diǎn)時，要點(diǎn)成圓點(diǎn)，不要點(diǎn)成小撇。(6)整個圖要美觀、整潔，還要特別注意準(zhǔn)確性。七、思考題1、使用油鏡時，為什么要先用低倍鏡觀察？2、油鏡使用原理是什么？3、繪出細(xì)菌三型圖。實(shí)驗(yàn)二細(xì)菌的簡單染色雖然各種類型的顯微鏡能夠觀察到微生物的各種形態(tài)結(jié)構(gòu)，但一般實(shí)驗(yàn)室常用的是普通光學(xué)顯微鏡。由于細(xì)菌體積小且透明，在活體細(xì)胞內(nèi)又含有大量的水分，因此，對光線的吸收和反射與水溶液相差不大。當(dāng)把細(xì)菌懸浮在水滴內(nèi)，放在顯微鏡下觀察時，由于與周圍背景沒有顯著的明暗差，難于看清它們的形狀，更談不上識別其細(xì)微結(jié)構(gòu)。而經(jīng)過染色，就可借助顏色的反襯作用比較清楚地看到菌體形態(tài)，亦即菌體表面及內(nèi)部結(jié)構(gòu)著色與背景形成鮮明對比，這樣便可在普通光學(xué)顯微鏡下清晰地觀察到微生物的形狀和結(jié)構(gòu)，因此，微生物染色技術(shù)是觀察微生物形態(tài)結(jié)構(gòu)的重要手段。本實(shí)驗(yàn)通過對細(xì)菌的染色觀察，使同學(xué)們在掌握細(xì)菌染色技術(shù)的基礎(chǔ)上，了解各種其他的染色制片技術(shù)；觀察微生物的各種形態(tài)結(jié)構(gòu)，以鞏固課堂知識，增強(qiáng)感性認(rèn)識。一、目的要求1．學(xué)習(xí)微生物涂片、染色的基本技術(shù)，掌握細(xì)菌的單染色方法及無菌操作技術(shù)。2．鞏固顯微鏡的使用方法。二、基本原理1.簡單染色法：所謂單染色法是利用單一染料對細(xì)菌進(jìn)行染色的一種方法。此法操作簡便，適用于菌體一般形態(tài)的觀察。在中性、堿性或弱酸性溶液中，細(xì)菌細(xì)胞通常帶負(fù)電荷，所以常用堿性染料進(jìn)行染色。堿性染料并不是堿，和其他染料一樣是一種鹽，電離時染料離子帶正電，易與帶負(fù)電荷的細(xì)菌結(jié)合而使細(xì)菌著色。例如，美藍(lán)（亞甲藍(lán)）實(shí)際上是氯化亞甲藍(lán)鹽，它可被電離成正、負(fù)離子：帶正電荷的染料離子可使細(xì)菌細(xì)胞染成藍(lán)色。常用的堿性染料除美藍(lán)外，還有結(jié)晶紫（crystalviolet）、堿性復(fù)紅（basicfu-chsin）、番紅（又稱沙黃，safranine）等。細(xì)菌體積小，較透明，如未經(jīng)染色常不易識別，而經(jīng)著色后，與背景形成鮮明的對比，使易于在顯微鏡下進(jìn)行觀察。三、器材1、活材料：培養(yǎng)24小時的大腸桿菌、葡萄球菌。2、染色液和試劑：草酸銨結(jié)晶紫、番紅、蒸餾水、無菌水、二甲苯、香柏油等。3、器材：廢液缸、洗瓶、載玻片、接種杯、酒精燈、擦鏡紙、顯微鏡。四、操作步驟（1）涂片：取干凈載玻片一塊，左手持菌液試管，右手持接種環(huán)在火焰上灼燒滅菌，待接種環(huán)冷卻后在火焰旁從試管中取一環(huán)菌液，在潔凈無脂的載玻片上涂直徑約0.5-1cm的均勻薄膜。如果從斜面或平板上取菌，用無菌環(huán)挑取少量菌體，涂在預(yù)先滴有一小滴無菌水的載玻片上，使其薄而均勻。（2）晾干：讓涂片自然晾干或者在酒精燈火焰上方文火烘干。（3）固定：手執(zhí)玻片一端，讓菌膜朝上，通過火焰2-3次固定（以不燙手為宜），使細(xì)胞質(zhì)凝固，以固定細(xì)菌的形態(tài)，并使其不易脫落。但不能在火焰上烤，否則細(xì)菌形態(tài)將毀壞。（4）染色：將固定過的涂片放在廢液缸上的擱架上，加一滴草酸銨結(jié)晶紫染色1-2min（5）水洗：用洗瓶或滴管緩慢沖洗涂片上的染色液，直至沖下之水無色時為止。（6）干燥：將洗過的涂片放在空氣中晾干或用吸水紙吸干。（7）鏡檢：先低倍觀察，再高倍觀察，并找出適當(dāng)?shù)囊曇昂?，將高倍鏡轉(zhuǎn)出，在涂片上加香柏油一滴，將油鏡頭浸入油滴中仔細(xì)調(diào)焦觀察細(xì)菌的形態(tài)。（8）改用番紅染色，重復(fù)以上過程。實(shí)驗(yàn)完畢后的處理：①將浸過油的鏡頭按下述方法擦拭干凈，a.先用擦鏡紙將油鏡頭上的油擦去。b.用擦鏡紙沾少許二甲苯將鏡頭擦2-3次。c.再用干凈的擦鏡紙將鏡頭擦2-3次。注意擦鏡頭時向一個方向擦拭。②觀察后的染色玻片用廢紙將香柏油擦干凈，放入回收容器內(nèi)。五、注意事項(xiàng)（1）要有對數(shù)生長期的菌種菌齡過小或過大均影響細(xì)菌的正常形態(tài)，菌齡太小還沒有分化完整，而菌齡過大，往往會發(fā)生自溶。（2）涂片不宜過厚，以免造成菌體重疊，不利于觀察形態(tài)。（3）火焰固定不宜過熱，否則會使細(xì)菌變形。六、實(shí)驗(yàn)報告1．結(jié)果繪出葡萄球菌和大腸桿菌的形態(tài)圖。2．思考題簡單染色應(yīng)注意哪些，為什么？實(shí)驗(yàn)三細(xì)菌的革蘭氏染色一.目的要求1.初步掌握細(xì)菌涂片方法2.學(xué)習(xí)并掌握革蘭氏染色法步驟二.革蘭氏染色的基本原理革蘭氏染色是丹麥醫(yī)生C.Gram（革蘭）于1884年發(fā)明的一種鑒別不同類型細(xì)菌的染色方法。根據(jù)細(xì)菌細(xì)胞壁的組分和結(jié)構(gòu)不同，通過革蘭氏染色法可將所有的細(xì)菌區(qū)分為兩大類G+和G-.三.實(shí)驗(yàn)材料（一）菌種：1.金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)斜面培養(yǎng)物2.大腸桿菌(E.coli)培養(yǎng)物（二）儀器與其他用品顯微鏡、酒精燈、火機(jī)（火柴）、接種環(huán)、載玻片、擦鏡紙、香柏油、二甲苯，無菌牙簽等。（三）革蘭氏染色液①草酸銨結(jié)晶紫染色液②革氏碘液③95%乙醇④0.5%番紅染液四.革蘭氏染色的過程–制片1、取干凈的載玻片，左手持菌液試管，右手持接種環(huán)在火焰上燒灼滅菌，待接種環(huán)冷卻后在火焰旁從試管中取一環(huán)菌液，在潔凈無脂的載玻片上涂一直徑約0.5-1cm的均勻薄膜。若從斜面或平板上取菌，用無菌接種環(huán)取少量菌體，涂在預(yù)先滴有一小滴無菌水的載玻片上，使其薄而均勻。革蘭氏染色的過程–染色2.初染：在做好的涂面上滴加草酸銨結(jié)晶紫染液，染1分鐘，傾去染液，流水沖洗至無紫色。3.媒染：先用新配的碘液沖去殘水，而后用其覆蓋涂面1分鐘，后水洗。4.脫色：除去殘水后，滴加95%酒精進(jìn)行脫色約20－30秒，使流出的酒精不再有紫色為止，后立即用流水沖洗。5.復(fù)染：滴加番紅染色液，染3－5分鐘，水洗后用吸水紙吸干。6.鏡檢：觀察染色結(jié)果。注意事項(xiàng)（1）革蘭氏染色注意載玻片要潔凈，滴無菌水和取菌不宜過多，涂片要均勻，不宜過厚；熱固定溫度不宜過高，（以玻片背面不燙手為宜），否則會改變甚至破壞細(xì)胞形態(tài)；水洗時不要直接沖洗涂面，而應(yīng)使水從載玻片的一端流下，水流不宜過急，過大，以免涂片薄層脫落。（2）革蘭氏染色結(jié)果是否正確，乙醇脫色是革蘭氏染色操作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，脫色不足，陰性菌被誤染成陽性