繪制雙倒數(shù)曲線-2

生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)堿性磷酸酶Km值的測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容二、實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響2、掌握米曼氏方程、Km值的意義及雙倒數(shù)作圖求Km的方法。一、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容（一）實(shí)驗(yàn)原理（二）實(shí)驗(yàn)操作（一）實(shí)驗(yàn)原理（磷酸苯二鈉法）磷酸氫二鈉

根據(jù)紅色深淺就可測(cè)出醌衍生物的含量，從而反映酶濃度一定時(shí)，底物濃度對(duì)酶的飽和效應(yīng)。底物濃度對(duì)反應(yīng)速度的影響：

呈矩形雙曲線[S]VVmax當(dāng)反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度一半時(shí)Km值的推導(dǎo)：Km＝[S]∴Km值等于酶促反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度，單位是mol/L。2＝Km+[S]

Vmax

Vmax[S]VmaxV[S]KmVmax/2

雙倒數(shù)作圖法(doublereciprocalplot)，又稱為林-貝氏(Lineweaver-Burk)作圖法

Vmax[S]Km+[S]V=（林－貝氏方程）+1/V=KmVmax

1/Vmax1/[S]兩邊同取倒數(shù)（二）實(shí)驗(yàn)操作1．取8支大試管，編號(hào)，按下表依次加入：管號(hào)試劑（ml）123456780.04mol／L底物液0.150.200.250.300.400.600.800.000.1mol／L碳酸緩沖液(pH10)0.900.900.900.900.900.900.900.90蒸餾水0.850.800.750.700.600.400.201.00混勻后，37℃水浴，預(yù)熱5min左右。

酶液0.10.10.10.10.10.10.10.1

每管加入酶液后立即混勻（保持在37℃水浴中），反應(yīng)開始，從加入酶液起計(jì)時(shí)至下一步加入堿性溶液停止反應(yīng)，各管反應(yīng)時(shí)間準(zhǔn)確一致，為15min。0.5mol／LNaOH（堿液）1.01.01.01.01.01.01.01.04-氨基安替比林1.01.01.01.01.01.01.01.0鐵氰化鉀2.02.02.02.02.02.02.02.0

混勻，室溫放置10min左右，以8號(hào)管空白調(diào)零，于510nm比色，記錄各管的吸光度。管號(hào)12345678A510值

空白調(diào)零【注意事項(xiàng)】1、底物、血清取量務(wù)必準(zhǔn)確。2、保溫時(shí)間務(wù)必準(zhǔn)確。3、繪制雙倒數(shù)曲線時(shí)，一定要過原點(diǎn)（二）721分光光度計(jì)的使用（三）常規(guī)儀器的使用2、數(shù)據(jù)結(jié)果計(jì)算底物濃度(mmol／L)34568121601／[S]0.3330.2500.2000.1670.1250.0830.063-1／v（1／A510）

-3、作圖要求：（1）繪制矩形雙曲線：縱軸（V）等距離吸光度標(biāo)識(shí)橫軸等距離底物濃度標(biāo)識(shí)曲線各管吸光度連線觀察曲線形狀OD[S]（2）繪制雙倒數(shù)曲線：橫軸等距離底物濃度的倒數(shù)（1／[s]）縱軸（1/V）等距離吸光度的倒數(shù)（1／A510）標(biāo)識(shí)曲線各管吸光度的倒數(shù)標(biāo)識(shí)觀察①直線形狀；②計(jì)算Km值二、實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求（一）實(shí)驗(yàn)名稱（二）實(shí)驗(yàn)原理（三）實(shí)驗(yàn)