山藥多糖的提取分離與測(cè)定

山藥多糖的提取分離與測(cè)定

山藥是甘薯科植物甘薯的干燥根莖。具有益脾健脾、益腎益精的功效。主要治療脾虛腹瀉、長(zhǎng)大便、虛證咳嗽、口渴、精子減少、排尿次數(shù)等癥狀。以往對(duì)山藥多糖的提取分離大多采用水提取,乙醇沉淀法和Savege去蛋白法得到較為純化多糖,并且含量測(cè)定通常采用紫外分光光度法。本實(shí)驗(yàn)采用水提取,乙醇和十六烷基三甲基溴銨鹽(CTAB)沉淀法,從山藥中分離純化得到多糖,并進(jìn)行了相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定;采用HPLC法測(cè)定了山藥總多糖含量,現(xiàn)報(bào)道如下。1藥物、藥物和生藥學(xué)試劑DIONEXUltimate3000高效液相色譜儀,包括脫氣機(jī)、高壓泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、示差檢測(cè)器、色譜工作站;凝膠柱為Phenomen的Luna5uC18100A(150mm×4.60mm);凝膠層析柱SephadexG-100(Pharmacia公司,3×100cm玻璃柱,床體積為500mL);葡萄糖(上?；瘜W(xué)試劑公司);CTAB(十六烷基三甲基溴胺鹽,Pharmacia公司);標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖(dextran,中國(guó)藥品及生物制品鑒定所);山藥購(gòu)自十堰市天寧醫(yī)藥公司,并經(jīng)本科室馬都文老師生藥學(xué)鑒定為DioscoreaoppositaThunb.;乙腈為色譜純;無(wú)水乙醇、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉均為分析純。2方法和結(jié)果2.1生化法檢測(cè)多糖藥材粉碎后,用8倍量水煎4h,過(guò)濾,藥渣同法再煎1次,兩次濾液合并,濃縮液以95%乙醇沉淀,離心分離得醇溶部分(Dr.1)和醇沉部分(Dr.2)。Dr.2用水溶解,離心除去不溶物,溶液用1%CTAB溶液沉淀,上清液以兩倍95%乙醇沉淀,所得沉淀經(jīng)水溶后再沉淀,冷凍干燥得到中性多糖部分,記為NDT;CTAB沉淀用4mol·mL-1氯化鈉溶解,離心除去不溶物,適當(dāng)濃縮后95%乙醇沉淀,沉淀經(jīng)冷凍干燥得到酸性多糖,記為SPT。NDT和SPT經(jīng)紫外檢測(cè)280nm無(wú)吸收,說(shuō)明基本無(wú)蛋白類成分,NDT經(jīng)SephadG-100凝膠層析(洗脫劑為水,流速為20mL·min-1),苯酚-硫酸法檢測(cè),合并主要吸收峰餾分,凍凍干燥得純化多糖S1和S2。凝膠層析圖見圖1。2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制2.2.1總多糖相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定由標(biāo)準(zhǔn)Dextran(相對(duì)分子質(zhì)量分別為57200,43000,21400,17500,50Dal)的分子量對(duì)數(shù)與保留時(shí)間求得標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程為:lgM=7.10-0.25t(r=-0.993),按同樣條件測(cè)定樣品S1和S2的保留時(shí)間,由回歸方程求得樣品S1和S2的相對(duì)分子質(zhì)量,相對(duì)分子質(zhì)量分別為62000和7300Dal。2.3測(cè)定了山芝糖的總含量2.3.1動(dòng)相、緩沖液、理論塔板的制備C18100A色譜柱(150mm×4.60mm);流動(dòng)相:乙腈、磷酸鹽緩沖液(70∶30);流速:1.5mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng):210nm;進(jìn)樣量:20μL;理論塔板數(shù):2500。對(duì)照品及總多糖的色譜圖見圖2。2.3.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制精密稱取葡萄糖對(duì)照品125mg,置50mL量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,搖勻。精密量取2.0,3.0,4.0,5.0,6.0mL分別置10mL量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻。各取溶液20μL分別注入色譜儀,記錄色譜圖,由峰面積(A)對(duì)溶液濃度(C)線性回歸,得回歸方程(n=5):A=100386C-6048,r=0.9996,葡萄糖在0.5～1.5g·L-1范圍內(nèi)呈線性。2.3.3加樣回收率的測(cè)定精密量取已知含量的樣品5mL,精密加入1g·L-1的葡萄糖對(duì)照品1mL,按含量測(cè)定方法項(xiàng)下制備所需溶液,并進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算回收率。經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)得平均回收率為93.26%,RSD為1.02%(n=5)。2.3.4精密度測(cè)試在選定的色譜條件下,取已知含量的樣品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次,按峰面積計(jì)算RSD為0.83%。2.3.5穩(wěn)定性試驗(yàn)取樣品按含量測(cè)定方法,每隔1h測(cè)定1次,在12h內(nèi)溶液穩(wěn)定,按峰面積計(jì)算RSD為1.2%。2.3.6標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備用微量移液器吸取山藥總多糖300μL于具塞離心管中,加無(wú)水乙醇600μL,蓋上塞子后充分振搖,置高速離心機(jī)以14000r·min-1離心5min,取上清液用0.45μm濾膜濾過(guò),以續(xù)濾液作為供試品溶液。精密量取20μL注入液相色譜儀;另取葡萄糖對(duì)照品用水制成每1mL含葡萄糖1mg的溶液,作為對(duì)照品溶液,同法測(cè)定,按外標(biāo)法計(jì)算,結(jié)果山藥總多糖的含量為16.42%,RSD為0.09%。3蛋白和活性化合物的分離純化本實(shí)驗(yàn)采用水提取,乙醇和十六烷基三甲基溴胺鹽(CTAB)沉淀法,對(duì)山藥中的多糖進(jìn)行了初步分離,從山藥中分離純化得到多糖,得到兩個(gè)多糖S1和S2,全水解產(chǎn)物的分析表明,它們的糖組成均為葡萄糖,HPLC分析顯示它們?yōu)榫欢嗵?相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定結(jié)果分別為62000和7300Dal。采用十六烷基三甲基溴銨鹽(CTAB)沉淀法除去蛋白和SephadexG-100柱層析可以得到純度較好的多糖。本實(shí)驗(yàn)收集到的多糖S1和S2由于量少而無(wú)法再做進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)分析,若需要對(duì)其進(jìn)行分析則須大量制備,此工作可以在以后開展。本實(shí)驗(yàn)曾采用過(guò)乙腈、水的流動(dòng)相,并與乙腈、磷酸鹽緩沖液的流動(dòng)相作比較,經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)采用乙腈、磷酸鹽緩沖液(70∶30)為本品含量測(cè)定的流動(dòng)相,所得峰形較好,