第3章 抗生素概述

生物制藥工藝學主講教師

生物工程系

第三章抗生素概述課程內(nèi)容：抗生素的分類；生產(chǎn)抗生素的工藝流程；抗生素的質(zhì)量控制重點與難點：抗生素的生產(chǎn)工藝流程知識目標：掌握生產(chǎn)抗生素的工藝流程；掌握抗生素的質(zhì)量控制；了解抗生素的分類技能目標：通過實訓，掌握抗生素的整個生產(chǎn)工藝流程，并知道整個工藝流程中的控制點一.抗生素的定義1.抗生素是生物在其生命活動過程中產(chǎn)生的（或并用化學、生物或生物化學）、在低微濃度下能選擇性地抑制或殺死它種生物機能的化學物質(zhì)。2.初級代謝產(chǎn)物和次級代謝產(chǎn)物初級代謝產(chǎn)物：它往往與細胞的生產(chǎn)代謝有密切關(guān)系，一般屬于能量代謝或分解代謝產(chǎn)物。如有機酸

次級代謝產(chǎn)物是微生物在細胞分化過程中產(chǎn)生的，往往不是細胞生長所必需的代謝產(chǎn)物。如抗生素屬于低相對分子質(zhì)量的次級代謝產(chǎn)物。二.醫(yī)用抗生素應具備的條件1.難使病源菌產(chǎn)生耐藥性2.較大的差異毒力3.最小抑菌濃度要低4.抗菌譜要廣第一節(jié)抗生素的發(fā)展史（一）抗生治療和抗生素的發(fā)現(xiàn)

1.相傳2500多年前，我們的祖先就用長在豆腐上的霉菌治療疥瘡等疾病。民間還有地方用發(fā)霉的面包，玉蜀黍等來治療潰瘍、腸道感染和化膿性感染等。

2.1928年Fleming在研究葡萄球菌變異時發(fā)現(xiàn)，污染在培養(yǎng)基上的霉菌抑制了細菌的生長。

→點青霉→青霉素→難提取→未引起重視

3.1940年代弗洛里（Florey）和錢恩（Chain）重新研究弗萊明工作4.1940～45年間，發(fā)展成了新的一個工業(yè)部門：抗生素發(fā)酵工業(yè)。

5.60年代半合成青霉素迅速發(fā)展。70年代抗生素品種迅速發(fā)展。1947年1948年1950年1952年1953年

50年代各國還致力于農(nóng)抗的研究，找到了如殺稻瘟素、六瘟素、春日霉素、多氧霉素、有效霉素等。

到現(xiàn)在為止，抗生素品種非常多。在臨床上應用的僅有120～350余種。（二）我國抗生素研究與發(fā)展1.解放前我國沒有抗生素工業(yè)。2.1953年建立了第一個生產(chǎn)青霉素的抗生素工廠以來，我國抗生素工業(yè)得到迅速發(fā)展。(三)我國抗生素應加強哪些方面呢？1.加強基礎理論研究和新技術(shù)的應用2.選育抗性菌種和新型菌株3.應當大力發(fā)展農(nóng)業(yè)抗生素第二節(jié)抗生素的分類

隨著新抗生素的不斷出現(xiàn)，需要將抗生素進行分類，以便于研究。今簡要將常見的分類方法列述如下：（一）根據(jù)抗生素的生物來源分類1.放線菌產(chǎn)生的抗生素

在所有已發(fā)現(xiàn)的抗生素中，由它產(chǎn)生的抗生素占一半以上，其中又以鏈霉菌屬產(chǎn)生的抗生素為最多、諾卡氏菌屬、小單抱菌屬次之。這類抗生素中主要有氨基糖苷類，如鏈霉素；四環(huán)類，如四環(huán)素；大環(huán)內(nèi)酯類，如紅霉素；多烯類，如制霉菌素；放線菌素類，如放線菌素D等。2.真菌產(chǎn)生的抗生素

在真菌的四個綱中，不完全菌綱中的青霉菌屬和頭孢菌屬等分別產(chǎn)生一些很重要的抗生素，如青霉素、頭孢菌素。其次為擔子菌綱。藻菌綱和子囊菌綱產(chǎn)生的抗生素很少。3.細菌產(chǎn)生的抗生素

由細菌產(chǎn)生的抗生素的主要來源是多粘桿菌、枯草桿菌、芽孢桿菌等。屬這類抗生素的有多粘菌素等。4.其它生物（植物、動物、海洋微生物）產(chǎn)生的抗生素例如從被子植物蒜中制得的蒜素；從動物臟器中制得的魚素(Ekmolin)等。（二）按醫(yī)療作用對象分類1.抗感染抗生素2.抗腫瘤抗生素：博來霉素3.降血脂抗生素：新霉素（三）按作用性質(zhì)分類1.繁殖期殺菌作用的抗生素：青霉素2.靜止期殺菌作用的抗生素：鏈霉素3.速效抑菌作用的抗生素：四環(huán)素4.慢效抑菌作用的抗生素：環(huán)絲氨酸（四）按應用范圍分類1.醫(yī)用抗生素：青霉素2.農(nóng)用抗生素：放線菌酮3.畜用抗生素：四環(huán)素4.食品保藏用抗生素5.工農(nóng)業(yè)產(chǎn)品防霉防腐用抗生素6.實驗試劑專用抗生素（五）按作用機制分類1.抑制或干擾細胞壁合成的抗生素：青霉素2.抑制或干擾蛋白質(zhì)合成的抗生素：鏈霉素3.抑制或干擾DNA、RNA合成的抗生素：博來霉素4.抑制或干擾細胞膜合成的抗生素：兩性霉B5.作用于能量代謝系統(tǒng)的抗生素：（六）按抗生素獲得途徑分類1.天然抗生素（發(fā)酵工程抗生素）：四環(huán)素類抗生素2.半合成抗生素：氨芐西林3.生物轉(zhuǎn)化與酶工程抗生素4.基因工程抗生素

（七）根據(jù)抗生素的生物合成途徑分類1.氨基酸、肽類衍生物A.簡單氨基酸衍生物：環(huán)絲氨酸、重氮絲氨酸等。B.寡肽抗生素：青霉素、頭孢菌素等。C.多肽類抗生素：多粘菌素、桿菌肽等。D.多肽大環(huán)內(nèi)酯類：放線菌素等。E.含嘌呤和嘧啶基團的抗生素：曲古霉素，嘌呤霉素等。2.糖類衍生物：A.糖苷類抗生素；B.與大環(huán)內(nèi)酯連接的糖苷抗生素。3.以乙酸，丙酸為單位的衍生物。A.乙酸衍生物：四環(huán)類，灰黃霉素等。B.丙酸衍生物：紅霉素等。C.多烯和多炔類抗生素：制霉菌素、曲古霉素等。(八)按化學結(jié)構(gòu)分類1.β—內(nèi)酰胺類抗生素包括青霉素類、頭孢菌素類等。它們都包含一個四元內(nèi)酰胺環(huán)。這是在當前通受重視的一類抗生素。

2.氨基糖苷類抗生素含有一個六元脂環(huán)，包括鏈霉素、慶大霉素等。它們既含有氨基糖苷，也含有氨基環(huán)醇的結(jié)構(gòu)。幻燈片25

3.大環(huán)內(nèi)酯類抗生素如紅霉素、麥迪加霉素(medicamycin)。它們含有一個大環(huán)內(nèi)酯作配糖體，以苷健和1—3個分子的糖相連。

4.四環(huán)類抗生素如四環(huán)素、土霉素等。它們以四并苯為母核。

5.多肽類抗生素如多粘菌素、桿菌肽等。它們多由細菌、特別是由產(chǎn)雹子的桿菌產(chǎn)生，并含有多種氨基酸，經(jīng)肽鍵縮合成線狀、環(huán)狀或帶側(cè)鏈的環(huán)狀多肽。第三節(jié)抗生素的應用一、抗生素劑量表示法1．折算重量單位：規(guī)定能抑制50ml標準肉湯的葡萄球菌為一個單位。1u＝0.6ug青霉素G.Na鹽；1mg青霉素G.Na＝1667u(1mg青霉素GNa可抑制83300ml肉湯中的葡萄球菌。)2．重量單位：以抗生素活性部分為一個單位：如慶大霉素堿1mg＝1000ug3．類似重量單位：以特定純粹鹽為重量單位：如鹽酸金霉素1mg＝1000u.4.特定單位：制霉菌素1mg＝3000u

桿菌肽1mg＝55u.

二、抗生素的應用1.抗生素在醫(yī)療上的應用（1）控制細菌感染性疾?。?）抑制腫瘤生長（3）調(diào)節(jié)人體生理功能（4）器官移植（5）控制病毒性感染2、抗生素在農(nóng)業(yè)上的應用（1）植物保護（2）促進或抑制植物生長3、在畜牧業(yè)上的應用（1）禽獸感染性疾病控制（2）飼料添加劑5、在工業(yè)上的應用（1）工業(yè)制品的防腐（2）提高特定發(fā)酵產(chǎn)品的產(chǎn)品6、在科學研究中的應用（1）生物化學與分子生物學研究的重要工具（2）建立藥物篩選與評價模型（3）其他實驗應用第四節(jié)抗生素工業(yè)生產(chǎn)及工藝一、抗生素工業(yè)的性質(zhì)1、理論產(chǎn)量很難從物料中計算出來2、抗生素的產(chǎn)量存在“生物學變量”3、發(fā)酵液中有效成分濃度低生產(chǎn)工藝圖二、抗生素生產(chǎn)工藝過程現(xiàn)代抗生素工業(yè)生產(chǎn)過程如下：菌種→孢子制備→種子制備→發(fā)酵→發(fā)酵液預處理→提取及精制→產(chǎn)品檢驗→成品包裝

無菌空氣消泡劑、補料

1、菌種（1）菌種制備從來源于自然界土壤等，獲得能產(chǎn)生抗生素的微生物，經(jīng)過分離、選育和純化后即稱為菌種。菌種可用冷凍干燥法制備后，以超低溫，即在液氮冰箱(-190℃~-196℃)內(nèi)保存。所謂冷凍干燥是用脫脂牛奶或葡萄糖液等和孢子混在一起，經(jīng)真空冷凍、升華干燥后，在真空下保存。如條件不足時，則沿用砂土管在0℃冰箱內(nèi)保存的老方法，但如需長期保存時不宜用此法。一般生產(chǎn)用菌株經(jīng)多次移植往往會發(fā)生變異而退化，故必須經(jīng)常進行菌種選育和純化以提高其生產(chǎn)能力。

（2）一個優(yōu)良菌種應具備那些條件?生長繁殖快，發(fā)酵單位高；遺傳性能穩(wěn)定，在一定條件下能保持持久的、高產(chǎn)量的抗生素生產(chǎn)能力；培養(yǎng)條件粗放，發(fā)酵過程易于控制；合成的代謝副產(chǎn)物少，生產(chǎn)抗生素的質(zhì)量好。2、孢子制備

生產(chǎn)用的菌株須經(jīng)純化和生產(chǎn)能力的檢驗，若符合規(guī)定，才能用來制備種子。制備孢子時，將保藏的處于休眠狀態(tài)的孢子，通過嚴格的無菌手續(xù)，將其接種到經(jīng)滅菌過的固體斜面培養(yǎng)基上，在一定溫度下培養(yǎng)5-7日或7日以上，這樣培養(yǎng)出來的孢子數(shù)量還是有限的。為獲得更多數(shù)量的孢子以供生產(chǎn)需要，必要時可進一步用扁瓶在固體培養(yǎng)基(如小米、大米、玉米粒或麩皮)上擴大培養(yǎng)。超凈工作臺雙層小容器搖床3、種子培養(yǎng)（1）種子培養(yǎng)的目的：使孢子發(fā)芽、繁殖以獲得足夠數(shù)量的菌絲，并接種到發(fā)酵罐中。（2）種子制備：從搖瓶培養(yǎng)開始，再接入種子罐中擴大培養(yǎng)；直接將孢子接入種子罐后逐級放大培養(yǎng)。（3）種子擴大培養(yǎng)級數(shù)：菌種的性質(zhì)生產(chǎn)規(guī)模的大小生產(chǎn)工藝特點擴大培養(yǎng)級數(shù)通常為二級(4)接種量：接種量視需要而定。如用菌絲，接種量一般相當于0.1%—2%(接種量的%，系對種子罐內(nèi)的培養(yǎng)基而言，下同)。從一級種子罐接入

二級種子罐接種量一般為5%—20%，培養(yǎng)溫度一般在25—30℃。如菌種系細菌，則在32—37℃培養(yǎng)。在罐內(nèi)培養(yǎng)過程中，需要攪拌和通入無菌空氣。控制罐溫、罐壓，并定時取樣作無菌試驗，觀察菌絲形態(tài)，測定種子液中發(fā)酵單位和進行生化分析等，并觀察無雜菌情況。種子質(zhì)量如合格方可移種到發(fā)酵罐中。

4、培養(yǎng)基的配制

在抗生素發(fā)酵生產(chǎn)中，由于各菌種的生理生化特性不一樣，采用的工藝不同，所需的培養(yǎng)基組成亦各異。即使同一菌種，在種子培養(yǎng)階段和不同發(fā)酵時期，其營養(yǎng)要求也不完全一樣。因此需根據(jù)其不同要求來選用培養(yǎng)基的成分與配比。其主要成分包括碳源、氮源、無機鹽類(包括微量元素)和前體等。

(1)碳源

主要用以供給菌種生命活動所需的能量，構(gòu)成菌體細胞及代謝產(chǎn)物。有的碳源還參與抗生素的生物合成，是培養(yǎng)基中主要組成之一，常用碳源包括淀粉、葡萄糖和油脂類。對有的品種，為節(jié)約成本也可用玉米粉作碳源以代淀粉。使用葡萄糖時，在必要時采用流加工藝，以有利于提高產(chǎn)量。油脂類往往還兼用作消沫劑。個別的抗生素發(fā)酵中也有用麥芽糖、乳糖或有機酸等作碳源的。

(2)氮源

主要用以構(gòu)成菌體細胞物質(zhì)(包括氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸)和含氮代謝物，亦包括用以生物合成含氮抗生素。氮源可分成兩類：有機氮源和無機氮源。有機氮源中包括黃豆餅粉、花生餅粉、棉籽餅粉(它如果經(jīng)精制以去除其中的棉酚后稱phamamedia)。玉米漿、蛋白胨、尿素、酵母粉、魚粉、蠶蛹粉和菌絲體等。無機氮源中包括氨水(氨水既作為氮源，也用以調(diào)節(jié)pH)，硫酸銨、硝酸鹽和磷酸氫二氨等。在含有機氮源的培養(yǎng)基中菌絲生長速度較快，菌絲量也較多。

(3)無機鹽和微量元素

抗生素產(chǎn)生菌和其他微生物一樣，在生長、繁殖和產(chǎn)生生物產(chǎn)品的過程中，需要某些無機鹽類和微量元素。如硫、磷、鎂、鐵、鉀、鈉、鋅、銅、鈷、錳等，其濃度與菌種的生理活性有一定影響。因此，應選擇合適的配比和濃度。此外，在發(fā)酵過程中可加入碳酸鈣作為緩沖劑以調(diào)節(jié)pH。

(4)前體

在抗生素生物合成中，菌體利用它以構(gòu)成抗生素分子中的一部分而其本身又沒有顯著改變的物質(zhì)，稱為前體(precursor)。前體除直接參與抗生素生物合成外，在一定條件下還控制菌體合成抗生素的方向并增加抗生素的產(chǎn)量。如苯乙酸成苯乙酰胺可用作為青霉素發(fā)酵的前體。丙醇或丙酸可作為紅毒素發(fā)酵的前體。前體的加入量應當適度。如過量則往往前體有毒性，并增加了生產(chǎn)成本。如不足，則發(fā)酵單位降低。

此外，有時還需要加入某種促進劑或抑制劑，如在四環(huán)素發(fā)酵中加入M-促進劑和抑制劑溴化鈉，以抑制金霉索的生物合成并增加四環(huán)素的產(chǎn)量。

(5)培養(yǎng)基的質(zhì)量

培養(yǎng)基的質(zhì)量應予嚴格控制，以保證發(fā)酵水平，可以通過化學分析，并在必要時作搖瓶試驗以控制其質(zhì)量。培養(yǎng)基的儲存條件對培養(yǎng)基質(zhì)量的影響應予注意。此外，如果在培養(yǎng)基滅菌過程中溫度過高、受熱時間過長亦能引起培養(yǎng)基成分的降解或變質(zhì)。培養(yǎng)基在配制時的調(diào)節(jié)其pH亦要嚴格按規(guī)程執(zhí)行。5、發(fā)酵（1）發(fā)酵目的：使微生物大量分泌抗生素（2）接種量：10%或10%—20%（3）發(fā)酵條件：設備和培養(yǎng)基要滅菌無菌空氣、攪拌罐溫和罐壓加入消沫劑以控制泡沫，必要時還加入酸、堿以調(diào)節(jié)發(fā)酵液的PH葡萄糖、銨鹽或前體（4）發(fā)酵參數(shù)：

菌絲形態(tài)和濃度、殘?zhí)橇?、氨基氮、抗生素含量、溶解氧、pH、通氣量、攪拌轉(zhuǎn)速和液面控制（5）發(fā)酵影響因素：pH、通氣量等6、發(fā)酵液的過濾和預處理

發(fā)酵液的過濾和預處理的目的：不僅在于分離菌絲，還需將一些雜質(zhì)除去。（1）發(fā)酵液預處理：發(fā)酵液中的雜質(zhì)如高價無機離子(Ca+2、Mg+2、Fe+3)和蛋白質(zhì)在離子交換的過程中對提煉影響甚大，不利于樹脂對抗生素的吸附。

對高價離子的去除，可采用草酸或磷酸。如加草酸則它與鈣離子生成的草酸鈣還能促使蛋白質(zhì)凝固以提高發(fā)酵濾液的質(zhì)量。如加磷酸(或磷酸鹽)，則既能降低鈣離子濃度，也易于去處鎂離子。Na5P3O10+Mg2+=MgNa3P3O10+Na+

對于蛋白質(zhì)，還可利用其在等電點時凝聚的特點而將其去除。蛋白質(zhì)一般以膠體狀態(tài)存在于發(fā)酵液中，膠體粒子的穩(wěn)定性和其所帶的電荷有關(guān)。它屬于兩性物質(zhì)，在酸性溶液中帶正電電荷，在堿性溶液中帶負電荷，而在某一pH下，凈電荷為零，溶解度最小，稱為等電點；因其羧基的電離度比氨基大，故很多蛋白質(zhì)的等電點在酸性(pH4.0—5.5)范圍內(nèi)。

對熱穩(wěn)定的抗生素發(fā)酵液還可用加熱法。使蛋白質(zhì)變性而降低其溶解度。加熱還能使發(fā)酵液粘度降低、加快濾速。

例如在鏈霉素生產(chǎn)中就可用加入草酸或磷酸將發(fā)酵液調(diào)至pH3.0左右，加熱至70℃，維持約半小時，用此方法來去除蛋白質(zhì)，這樣濾速可增大10—100倍。濾液粘度可降低至1/6。如抗生素對熱不穩(wěn)定，則不應采用此法。

在發(fā)酵濾液中多數(shù)膠體粒子帶負電荷，因而用陽離子絮凝劑功效較高。例如可用含有季胺基團的聚苯乙烯衍生物，分子量在26000—55000范圍內(nèi)。加入絮凝劑后析出的雜質(zhì)再經(jīng)過濾除去，以利于以后的提取。(2)發(fā)酵液的過濾

發(fā)酵液為非牛頓型液體、很難過濾。過濾的難易與發(fā)酵培養(yǎng)基和工藝條件，以及是否染菌等因素有關(guān)。過濾如用板框壓濾則勞動強度大，影響衛(wèi)生，菌絲流入下水道時還影響污水處理。故以選用鼓式真空過濾機為宜，并在必要時在轉(zhuǎn)鼓表層涂以助濾劑硅藻土。當轉(zhuǎn)數(shù)旋轉(zhuǎn)時，以刮刀將助濾劑連同菌體薄薄刮去一層，以使過濾面不斷更新。

另一種設備是自動出渣離心機，但所排出的菌絲濾渣中尚含有較大量的發(fā)酵液，因此如要提高過濾收率，可將此濾渣以水洗后再次用同樣型號離心機分離。第一次和第二次離心分離液體合并后進入下一工序。再一種設備稱傾析器(Decanter)。它既可用于固、液相的分離，也可用于固相、有機溶媒相和水相三者的混合和分離，從而將過濾菌絲和溶媒萃取這兩步合并在這一設備中完成。這就簡化了發(fā)酵液后處理工藝，提高了收率，并縮短了生產(chǎn)周期，也節(jié)約了勞力、動力、廠房和成本。

7、抗生素的提取

提取時目的是在于從發(fā)酵液中制取高純度的符合藥典規(guī)定的抗生素成品。在發(fā)酵濾液中抗生素濃度很低，而雜質(zhì)的濃度相對地較高。

雜質(zhì)中有無機鹽、殘?zhí)恰⒅?、各種蛋白質(zhì)及其降解物、色素、熱原質(zhì)、或有毒性物質(zhì)等。此外，還可能有一些雜質(zhì)其性質(zhì)和抗生素很相似，這就增加了提取和精制的困難。

由于多數(shù)抗生素不很穩(wěn)定，且發(fā)酵液易被污染，故整個提取過程要求：1)時間短；2)溫度低；3)pH宜選擇對抗生素較穩(wěn)定的范圍；4)勤清洗消毒(包括廠房、設備、管路并注意消滅死角)。

常用的抗生素提取方法包括有溶媒萃取法、離子交換法和沉淀法等。離子交換8、抗生素的精制

這是抗生素生產(chǎn)最后工序。對產(chǎn)品進行精制、烘干和包裝的階段要符合“藥品生產(chǎn)管理規(guī)范(即GMP)"的規(guī)定。例如其中規(guī)定產(chǎn)品質(zhì)量檢驗應合格、技術(shù)文件應齊全、生產(chǎn)和檢驗人員應具有一定素質(zhì)；

設備材質(zhì)不應能與藥品起反應、并易清洗，空調(diào)應按規(guī)定的級別要求，各項原始記錄、批報和留樣應妥為保存，對注射品應嚴格按無菌操作的要求等。

下面對抗生素精制中可選用的步驟分述如下：A脫色和去熱原質(zhì)脫色和去熱原質(zhì)是精制注射用抗生素中不可缺少的一步。它關(guān)系到成品的色級及熱原試驗等質(zhì)量指標。色素往往是在發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，它與菌種和發(fā)酵條件有關(guān)。熱原質(zhì)是在生產(chǎn)過程中由于被污染后由雜菌所產(chǎn)生的一種內(nèi)毒素。

各種雜菌所產(chǎn)生的熱原反應有所不同。革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的熱原反應一般比革蘭氏陽性菌的為強。熱原注入體內(nèi)引起惡寒高熱，嚴重的引起休克。它是多糖磷類脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的結(jié)合體，為大分子有機物質(zhì)，能溶于水。在280℃加熱4h它能被破壞90%；180—200℃加熱半小時或150℃加熱2h能被徹底破壞。

它亦能被強酸、強堿、氧化劑(如高錳酸酸鉀)等破壞。它能通過一般濾器，但能被活性炭、石棉濾材等所吸附。生產(chǎn)中常用活性炭脫色去除熱原，但須注意脫色時pH，溫度、炭用量及脫色時間等因素，還應考慮它對抗生素的吸附問題，否則能影此外，也可用脫色樹脂去