cd133和內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)的意義

cd133和內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)的意義

非小細(xì)胞肺癌（iurc）患者術(shù)后死亡的主要原因之一是該國(guó)的。腫瘤干細(xì)胞(TSC)理論認(rèn)為,TSC是存在于腫瘤組織中的一小部分具有干細(xì)胞性質(zhì)的細(xì)胞群體,它們具有自我更新能力和多向分化潛能,是形成不同分化程度腫瘤細(xì)胞和促使腫瘤不斷生長(zhǎng)的根源。CD133是腫瘤干細(xì)胞的特征性表面標(biāo)志物之一,在腦腫瘤、肝癌和結(jié)腸癌中已發(fā)現(xiàn)CD133陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞的成瘤性比陰性細(xì)胞強(qiáng)。內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶(ECE)是血管內(nèi)皮素生物合成的關(guān)鍵酶,催化內(nèi)皮素合成的最后過(guò)程,與多種惡性腫瘤的生物學(xué)行為有著密切關(guān)系。本研究采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)77例NSCLC組織中CD133和ECE蛋白的表達(dá)情況,探討它們與腫瘤大小、組織學(xué)類型、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和術(shù)后生存時(shí)間的關(guān)系。1數(shù)據(jù)和方法1.1試劑CD133多克隆抗體(北京博奧森公司),ECE多單克隆抗體和SABC試劑盒(武漢BOSTER公司)。1.2病例選擇及手術(shù)過(guò)程所有患者知情同意。選取本院胸外科1996~2001年手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的有術(shù)后隨訪資料的NSCLC患者77例,男57、女20例;年齡29~79歲(中位年齡63歲)。術(shù)中發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率54.5%(42/77)。術(shù)后病理診斷報(bào)告:鱗癌32.5%(25/77),腺癌51.9%(40/77),肺泡細(xì)胞癌9.1%(7/77),大細(xì)胞未分化癌5.2%(4/77),粘液表皮樣癌1.3%(1/77);其中高分化45.5%(35/77),中分化19.5%(15/77),低分化及未分化35.1%(27/77)。本組病例到隨訪結(jié)束時(shí)(2004年12月)死亡率72.73%(56/77)。術(shù)后生存時(shí)間1~84個(gè)月,中位生存時(shí)間19月。所有患者手術(shù)前均未進(jìn)行放療或化療。根據(jù)影像學(xué)資料或手術(shù)記錄確定腫瘤大小。查閱住院記錄獲得腫瘤組織學(xué)類型、組織分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。所有手術(shù)切除標(biāo)本均用10%甲醛固定,石蠟包埋切片,厚4μm。1.3免疫藥物維持治療石蠟包埋組織切片,脫蠟水化,蒸餾水漂洗5min,在拘緣酸微緩沖液波爐抗原修復(fù)(95~98℃維持20min)。室溫下冷卻30min,磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗5min,3%H2O2室溫下孵育10min,PBS漂洗3×5min。CD133一抗稀釋度為1∶200,稀釋劑為PBS;ECE一抗稀釋度為1∶50,稀釋劑為正常血清,陽(yáng)性對(duì)照為已知陽(yáng)性的神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織,以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。4℃冰箱中過(guò)夜。第2天取出置室溫1h后,PBS漂洗3×5min,滴加生化素標(biāo)記的第二抗體,37℃孵育30min,PBS漂洗3×5min。滴加鏈霉素化蛋白生物素復(fù)合物,37℃孵育30min,PBS漂洗3×5min,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色3~10min。蒸餾水漂洗,蘇木精復(fù)染細(xì)胞核,中性樹(shù)膠封片。1.4細(xì)胞數(shù)檢測(cè)DAB陽(yáng)性染色為棕(黃)色。計(jì)數(shù)4個(gè)不同高倍視野下200個(gè)癌細(xì)胞,陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>10%為陽(yáng)性,≤10%為陰性。由3位病理科醫(yī)生在不了解患者臨床預(yù)后情況下獨(dú)立進(jìn)行觀察判斷,對(duì)獨(dú)立判斷不一致的病例再共同進(jìn)行觀察。1.5率-生存分析數(shù)據(jù)用SPSS11.5處理,腫瘤大小的比較采用t檢驗(yàn),率的比較用χ2檢驗(yàn),生存分析采用Kaplan-Meier曲線法和Log-Rank檢驗(yàn),Pearson法計(jì)算相關(guān)系數(shù)。2結(jié)果2.1sdc組織中cd133和ece的表達(dá)77例NSCLC組織中,CD133陽(yáng)性表達(dá)率51.9%(40/77)(圖1);ECE陽(yáng)性表達(dá)率45.5%(35/77)(圖2)。2.2淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率測(cè)定CD133陽(yáng)性組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為62.5%(25/40),較陰性組的45.9%(17/37)高(r=0.246,P=0.031);ECE陽(yáng)性組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為80.0%(28/35),較陰性組的33.3%(14/42)高(r=0.339,P=0.003,表1)。CD133和ECE的陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤大小、組織學(xué)類型、組織分化程度均無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。2.3個(gè)月明顯短于陰性表達(dá)組33個(gè)月CD133陽(yáng)性表達(dá)組術(shù)后生存期的中位生存時(shí)間(10個(gè)月)明顯短于陰性表達(dá)組(37個(gè)月)(P<0.05)。ECE陽(yáng)性表達(dá)組術(shù)后生存期的中位生存時(shí)間(12個(gè)月)明顯短于陰性表達(dá)組(30個(gè)月)(P=0.007)。2.4cd133與epe的關(guān)系CD133與ECE的表達(dá)之間呈正相關(guān)性(r=0.249,P=0.027,表2)。3討論3.1cd133陽(yáng)性的細(xì)胞所具有的表達(dá)傳統(tǒng)理論認(rèn)為腫瘤生長(zhǎng)是所有腫瘤細(xì)胞一起增殖的結(jié)果,因而治療方法主要是針對(duì)腫瘤組織內(nèi)的大多數(shù)細(xì)胞,結(jié)果常因腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)而使治療失敗。TSC又稱為癌干細(xì)胞,包括干細(xì)胞樣細(xì)胞、癌起始細(xì)胞和腫瘤起始細(xì)胞等。腫瘤干細(xì)胞理論是對(duì)傳統(tǒng)腫瘤治療方式的巨大挑戰(zhàn),它提示腫瘤治療可靶向性殺死腫瘤干細(xì)胞,使根治腫瘤和防止腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移成為可能。CD133是傳統(tǒng)的造血干細(xì)胞、血液腫瘤和內(nèi)皮組細(xì)胞的標(biāo)志物。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)越來(lái)越多的腫瘤干細(xì)胞與CD133抗原表達(dá)有關(guān);Suetsugua等從肝癌細(xì)胞株Huh-7中分離出CD133陽(yáng)性細(xì)胞增殖能力比CD133陰性的細(xì)胞強(qiáng),且CD133陽(yáng)性細(xì)胞谷氨酰胺合成酶和細(xì)胞色素P450等成熟肝細(xì)胞標(biāo)志物的mRNA表達(dá)水平低,說(shuō)明CD133陽(yáng)性肝癌細(xì)胞處于相對(duì)幼稚的干細(xì)胞狀態(tài)。臨床研究工作中迄今報(bào)道的成瘤性最強(qiáng)的是腦瘤干細(xì)胞,每只NOD/SCID小鼠接種100個(gè)CD133陽(yáng)性腫瘤干細(xì)胞,結(jié)果在接種后6個(gè)月內(nèi)形成腫瘤;而每只接種十萬(wàn)個(gè)CD133陰性非腫瘤干細(xì)胞的小鼠在相同時(shí)間內(nèi)未形成腫瘤。Catherine等用流式細(xì)胞儀純化結(jié)腸癌組織中的CD133陽(yáng)性細(xì)胞,并把它們移植到NOD/SCID小鼠腎被膜下,發(fā)現(xiàn)所有結(jié)腸癌C-IC都是CD133陽(yáng)性細(xì)胞,而那些占腫瘤大多數(shù)的CD133陰性細(xì)胞沒(méi)有致瘤性;每262個(gè)CD133陽(yáng)性細(xì)胞就有一個(gè)C-IC,而未純化的結(jié)腸癌組織中每5.7×104個(gè)細(xì)胞才有一個(gè)C-IC。肺癌干細(xì)胞也有實(shí)驗(yàn)性研究報(bào)道,但到目前為止,國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)從人類肺癌組織中分離出肺癌干細(xì)胞的報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)肺癌標(biāo)本中CD133陽(yáng)性表達(dá)與患者的淋巴轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān),即患者肺癌組織中的CD133表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞越多,其腫瘤發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的可能性就越大,術(shù)后生存時(shí)間也就越短,提示腫瘤組織中CD133陽(yáng)性細(xì)胞越多,腫瘤組織中含有的TSC就越多,手術(shù)后殘留在患者體內(nèi)的TSC也就較多。這些殘留的TSC通過(guò)自我更新和多向分化,導(dǎo)致發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。CD133可能就是肺癌干細(xì)胞的特導(dǎo)性表面標(biāo)志物。這為今后肺癌干細(xì)胞標(biāo)志物的確定和肺癌TSC的分選指明了方向。3.2ece對(duì)血管內(nèi)皮功能的影響內(nèi)皮素系統(tǒng)通過(guò)增加血管生成等多種機(jī)制促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。ECE是內(nèi)皮素的轉(zhuǎn)化酶,在內(nèi)皮素的生物合成中起著關(guān)鍵作用。Boldrini等用RT-PCR檢測(cè)210例NSCLC組織和正常肺組織中的內(nèi)皮素-1(ET-1)、ECE-1和內(nèi)皮素受體的表達(dá)情況,以血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子為對(duì)照,發(fā)現(xiàn)NSCLC中ECE-1的陽(yáng)性表達(dá)率(38.3%)高于正常肺組織中的表達(dá)(16.5%)。Awano等發(fā)現(xiàn)ECE-1可刺激口腔鱗癌細(xì)胞增值,采用RNA干擾(siRNA)方法特異性抑制ECE的表達(dá),可抑制癌細(xì)胞的增殖,因此他們提出抑制內(nèi)皮素系統(tǒng)可能是一種新的腫瘤治療方法。本研究也發(fā)現(xiàn),淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組NSCLC患者ECE的陽(yáng)性率明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組,且ECE過(guò)度表達(dá)的NSCLC患者預(yù)后不良,提示ECE對(duì)NSCLC生物學(xué)行為的影響可能是通過(guò)影響腫瘤細(xì)胞增生、腫瘤血管形成等多種機(jī)制而發(fā)生作用。今后可以進(jìn)一步從ECE、內(nèi)皮素和內(nèi)皮