第二章 基因工程制藥(三)

第二章基因工程制藥

(三）1第二章基因工程制藥九、基因工程藥物的分離純化基因工程藥物或生物技術(shù)產(chǎn)品特點：表達(dá)產(chǎn)物在初始料中含量較低含有大量細(xì)胞及代謝產(chǎn)物表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定性差，易失活變性表達(dá)產(chǎn)物的種類繁多、結(jié)構(gòu)不一、活性各異對其質(zhì)量要求純度高、無菌、無熱原2第二章基因工程制藥建立分離純化工藝的依據(jù)含目的產(chǎn)物的初始物料的特點物料中雜質(zhì)種類和性質(zhì)目的產(chǎn)物特性產(chǎn)品質(zhì)量要求3第二章基因工程制藥含目的產(chǎn)物的初始物料的特點菌種的類型及其代謝特性原材料培養(yǎng)基的來源及其質(zhì)量生產(chǎn)工藝及條件起始物料的物理、化學(xué)和生物學(xué)特性4第二章基因工程制藥物料中雜質(zhì)種類和性質(zhì)相關(guān)性和非相關(guān)性雜質(zhì)的含量、化學(xué)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、相對分子質(zhì)量。電荷性質(zhì)及數(shù)量、生物學(xué)性質(zhì)。穩(wěn)定性包括對熱、pH、鹽、有機(jī)溶劑等。溶解度、分配系數(shù)。揮發(fā)性、吸附性能。5第二章基因工程制藥目的產(chǎn)物特性

化學(xué)、物理和生物學(xué)特性，包括化學(xué)組成、相對分子質(zhì)量、等電點、電荷分布及密度、溶解度、穩(wěn)定性（對熱、冷凍、pH、鹽、有機(jī)溶劑和金屬離子等）。疏水性、擴(kuò)散系數(shù)、分配系數(shù)、吸附性能。生物活性、親和性、配基種類及表面活性等。6第二章基因工程制藥產(chǎn)品質(zhì)量要求產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)、用途。對純度、生物活性、比活的要求。允許的雜質(zhì)種類和最大允許含量。特殊雜質(zhì)的種類和最大允許量。產(chǎn)品劑型、貯存穩(wěn)定性等。7第二章基因工程制藥分離純化的基本過程由于基因工程藥物是從轉(zhuǎn)化細(xì)胞、而不是從正常細(xì)胞生產(chǎn)的，所以對產(chǎn)品的純度要求也要高于傳統(tǒng)產(chǎn)品。基因工程藥物的分離純化一般不應(yīng)超過4～5個步驟。主要包括細(xì)胞破碎、固液分離、濃縮與初步純化、高度純化直至得到純品以及成品加工。8第二章基因工程制藥基因工程藥物分離純化的一般流程9第二章基因工程制藥細(xì)胞破碎與固液分離

細(xì)胞收集：離心法、膜分離法。細(xì)胞破碎：機(jī)械破碎法、非機(jī)械破碎法。固液分離10第二章基因工程制藥各種組織細(xì)胞破碎方法11第二章基因工程制藥目的產(chǎn)物的分離純化12第二章基因工程制藥產(chǎn)物的主要特性及在分離純化中的作用13第二章基因工程制藥基因工程藥物生產(chǎn)中常用的分離純化方法14第二章基因工程制藥分離純化工藝應(yīng)遵循的原則15第二章基因工程制藥針對不同產(chǎn)物表達(dá)形式采用不同的策略16第二章基因工程制藥目標(biāo)產(chǎn)物分離常用的色譜方法

分離純化目的產(chǎn)物主要依賴色譜分離技術(shù)，常用的有：Ionexchangechromatography(IEC)Affinitychromatography(AC)GelFiltrationChromatography(GFC)Hydrophobicinteractionchromatography(HIC)17第二章基因工程制藥針對不同性質(zhì)的重組蛋白選擇不同的層析類型18第二章基因工程制藥多種分離純化技術(shù)的聯(lián)合運用19第二章基因工程制藥包含體的形成

原核、酵母和真核生物由于異源和同源蛋白過表達(dá)形成的致密的不溶性顆粒。包含體的形成與過表達(dá)蛋白的內(nèi)在性質(zhì)（如分子量、折疊途徑等）無直接關(guān)系。大腸桿菌胞質(zhì)環(huán)境是一個還原性環(huán)境，含有二硫鍵的蛋白質(zhì)容易錯誤折疊形成包含體。20第二章基因工程制藥包含體的分離、溶解和復(fù)性二硫蘇糖醇

21第二章基因工程制藥常用蛋白質(zhì)、酶和重組蛋白質(zhì)純化技術(shù)22第二章基因工程制藥層析分離技術(shù)（Chromatography)層析是廣泛使用的分離蛋白質(zhì)的方法，它是根據(jù)蛋白質(zhì)的形態(tài)、大小和電荷的不同而設(shè)計的物理分離方法。目前分離純化蛋白質(zhì)常用的層析方法：

離子交換層析親和層析凝膠過濾層析23第二章基因工程制藥離子交換層析（IonExchangeChromatographyIEC）以離子交換劑為固定相，以特定的含離子溶液為流動相，利用離子交換劑對待分離的各種離子結(jié)合力的差異，而將混合物中不同離子進(jìn)行分離的層析技術(shù)。利用蛋白質(zhì)帶電性的差異，在離子吸附劑上靜電吸附能力不同，用不同的pH/離子強(qiáng)度洗脫液洗脫，從而使蛋白質(zhì)分離。具有分辨率高容量大操作容易，該法已成為多肽蛋白質(zhì)核酸分離純化的重要方法。24第二章基因工程制藥25第二章基因工程制藥離子交換介質(zhì)的基本性質(zhì)26第二章基因工程制藥27第二章基因工程制藥28第二章基因工程制藥29第二章基因工程制藥30第二章基因工程制藥離子交換介質(zhì)的選擇原則31第二章基因工程制藥離子交換介質(zhì)的選擇原則32第二章基因工程制藥離子交換層析的基本操作層析柱平衡平衡緩沖液的用量至少為柱體積的2倍。平衡緩沖液的流速可略高于正常操作流速。平衡終點以流出液的離子濃度、導(dǎo)電性、pH值與緩沖液一致為準(zhǔn)，其中pH值最重要。樣品進(jìn)柱為了達(dá)到滿意的分離效果，進(jìn)樣量一般為介質(zhì)交換量的10～20％，為了避免進(jìn)樣溶液中離子強(qiáng)度過高，樣品濃度不宜太高。交換容量：離子交換劑中全部可交換的離子或功能集團(tuán)的總數(shù)。33第二章基因工程制藥離子交換層析需注意的問題34第二章基因工程制藥離子交換層析的應(yīng)用

20種氨基酸中大部分帶正電或負(fù)電，這是IEC應(yīng)用范圍廣的原因。IEC處理量大，附載系數(shù)高，一步縮小樣品體積很多。IEC去除雜質(zhì)能力強(qiáng)，如對熱原、核酸、外毒素等。利用蛋白質(zhì)在不同pH和鹽濃度下帶電性的不同，分兩步IEC使目標(biāo)蛋白達(dá)到提純目的。IEC原則上講可放在純化工藝的任何一步，它屬于吸附層析，單步損失也較大。35第二章基因工程制藥親和層析（AffinityChromatography，AC）

親和層析是利用固定化配基與目的蛋白質(zhì)之間特異的生物親和力進(jìn)行吸附，如抗體與抗原、受體與激素、酶與底物之間的作用。36第二章基因工程制藥親和層析配基：在親和層析中起可逆性結(jié)合的特異性物質(zhì)。載體：與配基結(jié)合的支撐物。親和層析大體可分三步：配基固定化吸附目的物樣品解吸37第二章基因工程制藥親和層析的特點AC具有分離純化目標(biāo)單一，回收率高的特點。從理論上講，AC得到的是相當(dāng)純的產(chǎn)物，這種分離能力是其它任何柱層析都難以相比的。AC柱制作工藝復(fù)雜，同時在色譜洗脫過程中配體不可避免的脫落，不但柱子的壽命有限，而且必須經(jīng)特別處理才能注射或服用，因此成本比較昂貴，一般不放在純化工藝的前面。38第二章基因工程制藥凝膠過濾（GelFiltrationChromatography）

凝膠過濾是以具有大小一定的多孔性凝膠作為分離介質(zhì)，小分子能進(jìn)入孔內(nèi)，在柱中緩慢移動，而大分子不能進(jìn)入孔內(nèi)，快速移動，利用這種移動差別可使大分子與小分子分開。39第二章基因工程制藥凝膠過濾根據(jù)蛋白質(zhì)的相對分子量和蛋白質(zhì)分子的動力學(xué)體積的大小差異，可以利用凝膠過濾來分離純化目的蛋白。主要應(yīng)用兩個方面：

脫鹽和更換緩沖液蛋白質(zhì)分子的分級分離。在產(chǎn)品的形成階段前用于除去產(chǎn)物的多聚體及降解產(chǎn)物。40第二章基因工程制藥疏水層析（HydrophobicInteractionChromatography，HIC）以蛋白質(zhì)疏水性為分離基礎(chǔ)。通過表面疏水性差異分離蛋白質(zhì)。疏水鍵的形成對于非極性基雙方無特異性要求，不同蛋白質(zhì)表面及內(nèi)部疏水區(qū)的多少、大小、強(qiáng)弱、分布及空間位阻效應(yīng)各不相同，這也是HIC分離蛋白質(zhì)的根本所在。在20種氨基酸中有8種是疏水性氨基酸，其強(qiáng)弱為：色氨酸（Trp）、異亮氨酸（ILe）、苯丙氨酸（Phe）、脯氨酸(Pro)、纈氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）、蛋氨酸（Met）、丙氨酸（Ala）。41第二章基因工程制藥影響HIC的因素42第二章基因工程制藥HIC的應(yīng)用43第二章基因工程制藥非蛋白質(zhì)雜質(zhì)的去除主要包括：DNA、熱原質(zhì)和病毒的純化方法。DNA的去除：DNA在pH4.0以上呈陰離子，蛋白質(zhì)的pI在6.0以上,可用陰離子交換劑吸附除去。如蛋白質(zhì)為強(qiáng)酸性，可選擇條件使其吸附在陽離子交換劑上，而DNA不吸附。親和層析和疏水層析也有效。44第二章基因工程制藥非蛋白質(zhì)雜質(zhì)的去除熱原質(zhì)的去除：熱原質(zhì)是腸桿菌科產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素（脂多糖）去除困難。分子量小的多肽或蛋白質(zhì)中的熱原可用超濾或反滲透，脂多糖是陰離子可用陰離子交換層析除去，脂多糖是疏水性可用疏水層析法。病毒的去除：層析或過濾可將病毒去除。45第二章基因工程制藥濃縮、干燥和保存蛋白質(zhì)的濃縮：

減壓加溫蒸發(fā)濃縮空氣流動蒸發(fā)濃縮冷凍法吸收法超濾法沉淀法46第二章基因工程制藥濃縮、干燥和保存47第二章基因工程制藥濃縮、干燥和保存48第二章基因工程制藥十、基因工程藥物的質(zhì)量控制

基因工程藥物的特點：用活細(xì)胞作為表達(dá)體系，所獲得的蛋白質(zhì)產(chǎn)品往往相對分子量較大，并有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，許多藥物是參與一些生理功能精密調(diào)節(jié)所必需的蛋白質(zhì)，所以任何藥物在性質(zhì)或劑量上的偏差，都可能造成嚴(yán)重的后果，從原料開始每一步都要進(jìn)行嚴(yán)格的控制。49第二章基因工程制藥基因工程藥物的質(zhì)量控制

宿主細(xì)胞中表達(dá)的外源基因，在轉(zhuǎn)錄翻譯精制工藝放大過程中都可能發(fā)生變化，故從原料以及制備全過程都必須嚴(yán)格控制條件和鑒定質(zhì)量。50第二章基因工程制藥原料的質(zhì)量控制

原料的質(zhì)量控制是為了保證編碼藥品的DNA序列的正確性，以及產(chǎn)品質(zhì)量的安全性和一致性。明確目的基因的來源、克隆經(jīng)過，并以限制性內(nèi)切酶酶切圖譜和核苷酸序列予以確證；應(yīng)提供表達(dá)載體的名稱、結(jié)構(gòu)、遺傳特性及各組成部分（如復(fù)制子、啟動子）的來源與功能，構(gòu)建中所用位點的酶切圖譜，抗生素抗性標(biāo)記物；51第二章基因工程制藥原料的質(zhì)量控制應(yīng)提供宿主細(xì)胞的名稱、來源、傳代歷史、檢定結(jié)果及其生物學(xué)特性；須闡明載體引入宿主細(xì)胞的方法及載體在宿主細(xì)胞與載體結(jié)合后的遺傳穩(wěn)定性；提供插入基因與表達(dá)載體兩側(cè)端控制區(qū)內(nèi)的核苷酸序列，詳細(xì)敘述在生產(chǎn)過程中啟動與控制基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的方法及水平等。52第二章基因工程制藥培養(yǎng)過程的質(zhì)量控制

在工程菌的貯存中，要求種子克隆純而穩(wěn)定；在培養(yǎng)過程中，要求工程菌所含的質(zhì)粒穩(wěn)定，始終無突變；在重復(fù)生產(chǎn)發(fā)酵中，工程菌表達(dá)穩(wěn)定；始終能排除外源微生物污染。53第二章基因工程制藥培養(yǎng)過程的質(zhì)量控制生產(chǎn)基因工程產(chǎn)品應(yīng)有種子批系統(tǒng)，并證明種子批不含有致癌因子，無細(xì)菌、病毒、真菌和支原體等污染，并由原始種子批建立生產(chǎn)用工作細(xì)胞庫。原始種子批須確證克隆基因DNA序列，詳細(xì)敘述種子批來源、方式、保存及預(yù)計使用期，保存與復(fù)蘇時宿主載體表達(dá)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。54第二章基因工程制藥培養(yǎng)過程的質(zhì)量控制對生產(chǎn)種子，應(yīng)詳細(xì)敘述細(xì)胞生長與產(chǎn)品生成的方法和材料，并控制微生物污染；提供培養(yǎng)生產(chǎn)濃度與產(chǎn)量恒定性數(shù)據(jù)，依據(jù)宿主細(xì)胞-載體系統(tǒng)穩(wěn)定性，確定最高允許傳種代數(shù)；在培養(yǎng)過程中，應(yīng)測定被表達(dá)基因分子的完整性及宿主細(xì)胞長期培養(yǎng)后的基因型特征；55第二章基因工程制藥培養(yǎng)過程的質(zhì)量控制依宿主細(xì)胞-載體穩(wěn)定性與產(chǎn)品恒定性，規(guī)定持續(xù)培養(yǎng)時間，并定期評價細(xì)胞系統(tǒng)和產(chǎn)品。培養(yǎng)周期結(jié)束時，應(yīng)監(jiān)測宿主細(xì)胞-載體系統(tǒng)的特性，如質(zhì)?？截悢?shù)、宿主細(xì)胞中表達(dá)載體存留程度，含插入基因載體的酶切圖譜等。56第二章基因工程制藥純化工藝過程的質(zhì)量控制要有足夠的生理和生物學(xué)試驗數(shù)據(jù)，確證提純分子批間保持一致性；外源蛋白質(zhì)、DNA與熱源質(zhì)都在規(guī)定的限度以下。在精制過程中能清除宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、核酸、糖類、病毒、培養(yǎng)基成分及精制工序本身引入的化學(xué)物質(zhì)。57第二章基因工程制藥目標(biāo)產(chǎn)品的質(zhì)量控制目標(biāo)產(chǎn)物的質(zhì)量控制主要包括以下幾項要求:產(chǎn)品的鑒別、純度、活性、安全性、穩(wěn)定性和一致性。它需要利用生物化學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)等多學(xué)科的理論與技術(shù)所建立的鑒定方法。58第二章基因工程制藥產(chǎn)品的鑒別

常用的鑒別方法：電泳方法:SDS、等電聚焦、免疫電泳；免疫學(xué)方法:放射免疫(RIA)、酶聯(lián)免疫(ELISA)；受體結(jié)合試驗；高效液相色譜(HPLC)；肽圖分析法；末端序列分析；圓二色譜；核磁共振等。59第二章基因工程制藥產(chǎn)品的鑒別肽圖分析：肽圖分析是用酶法或化學(xué)法降解目的蛋白質(zhì),對生成的肽段進(jìn)行分離分析。檢測蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)最有效的方法。該技