第三章上DNA復(fù)制+++1

第三章：遺傳信息的復(fù)制中心法則

(TheCentralDogma)轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄DNARNA蛋白質(zhì)復(fù)制有絲分裂細(xì)胞周期（cellcycle）G1期S期間期（interphase）

細(xì)胞周期G2期前期(prophase)M期中期(metaphase)

后期(anaphase)

末期(telophase)

為什么還要學(xué)習(xí)DNA的復(fù)制?1,詳細(xì)探究DNA復(fù)制的分子機制對認(rèn)識生命現(xiàn)象有重要的意義人類的壽命,疾病…….2,基于復(fù)制原理發(fā)展的生物技術(shù)在工農(nóng)業(yè)上均發(fā)揮著重要的作用.內(nèi)容提要：●DNA的半保留復(fù)制●與DNA復(fù)制有關(guān)的物質(zhì)●DNA的復(fù)制過程（大腸桿菌為例）●DNA復(fù)制的其它方式●真核生物中DNA的復(fù)制特點●基于復(fù)制原理的PCR技術(shù)DNA復(fù)制

第一部分DNA半保留復(fù)制DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)奠定了分子生物學(xué)的基礎(chǔ)DNA的復(fù)制

由Watson-Crick模型預(yù)言的DNA復(fù)制是半保留式的。半保留復(fù)制（semiconservativeReplication）：每個子代DNA分子含有一條舊鏈和一條新鏈。半保留復(fù)制SemiconservativeReplication每個子代DNA分子含有一條舊鏈和一條新鏈。DNA的復(fù)制□DNA是遺傳物質(zhì)，作為遺傳物質(zhì)的首要條件是必須能自我復(fù)制?！鮓atson和Crick闡明的DNA模型預(yù)示了DNA具有復(fù)制的能力，通過氫鍵配對的方式復(fù)制新鏈?！踉O(shè)想有三種復(fù)制方式：（1）半保留式；（2）保留式；（3）分散式。(1)+(2)+(3)+曾設(shè)想有三種復(fù)制方式：保留式，半保留式，分散式1、定義：由親代DNA生成子代DNA時，每個新形成的子代DNA中，一條鏈來自親代DNA，而另一條鏈則是新合成的，這種復(fù)制方式稱半保留復(fù)制。DNA的半保留復(fù)制2、實驗證據(jù)（1958Messelson和Stahl）：

MatthewMesselsonFranklinStahl1930.05.241929.10.08PhotographtakenbyF.L.HolmesofMattMeselsonandFrankStahlin1996,standingatthesitewheretheymetatWoodsHole42yearsearlier.Meselson-stahl實驗1958年，Meselson等證明DNA的復(fù)制是半保留式的。1．氯化銫超離心技術(shù)的原理DNA在CsCl溶液中經(jīng)超速離心后，最終停留在某一位置上，這時離心力的大小正好等于DNA分子在CsCl梯度中的浮力。DNA的浮力是由其密度決定的。根據(jù)離心后DNA在梯度中達到的平衡位置的不同可以將不同密度的DNA分子分開，例如：15NDNA和14NDNA。2．將E.coli培養(yǎng)在含有“重”同位素15N的培養(yǎng)基中，經(jīng)多個世代后，細(xì)胞中DNA就標(biāo)記上“重”同位素。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)到14N培養(yǎng)基中，經(jīng)過一個或兩個細(xì)胞分裂周期后，分離DNA，再進行CsCl離心。3.結(jié)果：經(jīng)一個世代后，DNA形成了一條中間密度帶。其位于“重”帶和“輕”帶之間。經(jīng)兩個世代培養(yǎng)后，DNA形成兩條帶，一條中間帶，一條輕帶。更直接的證據(jù)是將在14N中生長一代的細(xì)胞DNA（15N14N）變性后離心，可以得到一條重帶和一條輕帶。說明第一代雜種分子是半保留復(fù)制的產(chǎn)物。雙鏈中一條是親代15N，另一條是新合成14N，DNA為15N14N。Meselson-stahl實驗TheMeselson-Stahlexperiment

Meselson-stahl實驗結(jié)果的解釋將H3-胸苷標(biāo)記大腸桿菌DNA,然后用溶菌酶把細(xì)胞臂消化掉,使完整的DNA釋放出來,鋪在透析膜上,通過放射自顯影的方法觀察DNA復(fù)制的狀態(tài),黑點的濃度和軌跡代表了DNA分子的密度和形狀.Cairns復(fù)制-大腸桿菌復(fù)制的直接證據(jù)DNA復(fù)制的機制其核心在于：DNA雙螺旋中的兩條鏈都攜帶相同的信息，其堿基對是互補的；因此，在復(fù)制過程中兩條親代鏈分離，分別作為模板引導(dǎo)酶催化的新生互補子鏈的合成，并遵循標(biāo)準(zhǔn)的堿基配對原則，兩條新生雙鏈在細(xì)胞分裂時分別進入兩個子細(xì)胞；DNA復(fù)制的復(fù)雜性1,DNA分子復(fù)制中的幾何學(xué)問題2,雙螺旋鏈的解開?3,一種酶僅能催化有限的化學(xué)反應(yīng)4,復(fù)制過程中的錯誤的糾正?5,不同生物DNA復(fù)制的方式及過程?

第二部分與DNA復(fù)制有關(guān)的物質(zhì)(一)引子:DNA分子復(fù)制中的幾何學(xué)問題基因組超螺旋電鏡結(jié)構(gòu)顯示，就整體而言，大腸桿菌的基因組是由大量超螺旋的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的原核生物基因組結(jié)構(gòu)6.8:140:11000:18000:1DNAdoublehelixNucleosome(10nmfiber)30nmFiberLoopsILoopsIIchromosomeDNA分子復(fù)制過程的幾何學(xué)線狀DNA形成的超螺旋環(huán)狀DNA形成的超螺旋DNA扭曲與雙螺旋相同（擰緊）DNA扭曲與雙螺旋相反（松開）負(fù)超螺旋松弛DNA正超螺旋大多數(shù)天然DNA都具有負(fù)超螺旋,在復(fù)制的開始階段可以緩解由于DNA復(fù)制而造成的超纏現(xiàn)象,當(dāng)原有的負(fù)超螺旋用完時(5%),就需要引入新的負(fù)超螺旋,以緩解復(fù)制的阻力.拓?fù)洚悩?gòu)體及拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)體：給定連接數(shù)的DNA分子。拓?fù)洚悩?gòu)酶：I型和II型、DNA促旋酶（ATP）。

ActionofatypeItopoisomerase.

ActionofatypeIItopoisomerase.

每一次反應(yīng)可以引入兩個負(fù)超螺旋（二）與DNA復(fù)制有關(guān)的物質(zhì)1、原料：四種脫氧核苷三磷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP)2、模板：以DNA的兩條鏈為模板鏈，合成子代DNA3、引物：DNA的合成需要一段RNA鏈作為引物4、引物合成酶（引發(fā)酶）：此酶以DNA為模板合成一段RNA,這段RNA作為合成DNA的引物。實質(zhì)是以DNA為模板的RNA聚合酶。5、DNA聚合酶:以DNA為模板的DNA合成酶●以四種脫氧核苷酸三磷酸為底物●反應(yīng)需要有模板的指導(dǎo)●反應(yīng)需要有3

-OH存在●DNA鏈的合成方向為5

3

DNA聚合酶的分類原核生物的DNA聚合酶：DNA-polⅠ（1958，ArthurKornberg）DNA-polⅡ(1971,ThomasKornberg）DNA-polⅢ(1972,ThomasKornberg）HewasthefirsttoidentifytheenzymecatalyzingthesynthesisofDNA,polymeraseI.InrecognitionoftheirworkelucidatingthebasicmechanismsofDNAreplication,theywereawardedtheNobelPrizein1959.ArthurKornberg(1918-2007)HisfatherisArthurKornberg(1918-2007),winnerofthe1959NobelPrizeinMedicine,andhisolderbrotherisRogerD.Kornberg(born1947),winnerofthe2006NobelPrizeinChemistry.科恩伯格的長子羅杰·科恩伯格子承父業(yè)，也在基因研究領(lǐng)域取得卓越成績。2006年12月，羅杰·科恩伯格憑借在“真核轉(zhuǎn)錄的分子基礎(chǔ)”研究領(lǐng)域的貢獻，獨享諾貝爾化學(xué)獎。ThomasKornbergborn1948——對復(fù)制中的錯誤進行校讀，對復(fù)制和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進行填補。DNA-polⅠ323個氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段

/

Klenow片段

604個氨基酸DNA聚合酶活性

5核酸外切酶活性常用工具酶N端C端木瓜蛋白酶DNA聚合酶Ⅰ的功能

1.5‘→3’聚合功能2.3‘→5’外切活性3.5‘→3’外切活性(1)切口平移（nicktranslation）；(2)鏈的置換；(3)模板轉(zhuǎn)換（template-switching）4.內(nèi)切酶活性核酸必須有5’磷酸末端,且已經(jīng)正確配對,以一個接一個的方式去除,可以是DNA,也可以是RNA.——在復(fù)制延長過程中

真正催化新鏈核苷酸聚合的酶DNA-polⅢ性質(zhì)聚合酶Ⅰ聚合酶Ⅱ聚合酶Ⅲ3'5'外切活性+++5'3'外切活性+--5'3'聚合活性+中+很低+很高新生鏈合成--+主要是對DNA損傷的修復(fù)；以及在DNA復(fù)制時切除RNA引物并填補其留下的空隙。修復(fù)紫外光引起的DNA損傷DNA復(fù)制的主要聚合酶，還具有3’-5’外切酶的校對功能，提高DNA復(fù)制的保真性原核生物中的DNA聚合酶(大腸桿菌）6、DNA連接酶（1967年發(fā)現(xiàn)）：若雙鏈DNA中一條鏈有切口，一端是3’-OH，另一端是5‘-磷酸基，連接酶可催化這兩端形成磷酸二酯鍵，而使切口連接。

但是它不能將兩條游離的DNA單鏈連接起來

DNA連接酶在DNA復(fù)制、損傷修復(fù)、重組等過程中起重要作用3‘5‘3‘5‘OHP7、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(DNATopisomerase)：拓?fù)洚悩?gòu)酶?：使DNA一條鏈發(fā)生斷裂和再連接，作用是松解負(fù)超螺旋。主要集中在活性轉(zhuǎn)錄區(qū)，同轉(zhuǎn)錄有關(guān)。

例：大腸桿菌中的ε蛋白拓?fù)洚悩?gòu)酶Π：該酶能暫時性地切斷和重新連接雙鏈DNA，作用是將負(fù)超螺旋引入DNA分子。同復(fù)制有關(guān)。例：大腸桿菌中的DNA旋轉(zhuǎn)酶8、DNA解螺旋酶/解鏈酶（DNAhelicase)

通過水解ATP獲得能量來解開雙鏈DNA。E.coli中的rep蛋白就是解螺旋酶，還有解螺旋酶I、II、III。rep蛋白沿3’

5’移動，而解螺旋酶I、II、III沿5’

3’移動。9、單鏈結(jié)合蛋白(SSBP-single-strandbindingprotein)：穩(wěn)定已被解開的DNA單鏈，阻止復(fù)性和保護單鏈不被核酸酶降解。第三部分:DNA的復(fù)制過程（大腸桿菌為例）雙鏈的解開RNA引物的合成DNA鏈的延伸切除RNA引物，填補缺口，連接相鄰的DNA片段DNA的復(fù)制有特定的起始位點，常包含富含A、T的區(qū)段叫做復(fù)制原點。

復(fù)制原點常用ori(或o）表示?；靖拍睿簭?fù)制起始區(qū)的結(jié)構(gòu)特點：（1）富含A－T的3個13bp的串聯(lián)重復(fù)序列，這可能和雙鏈易于解開起始復(fù)制有關(guān)；（2）具有4個9bp的反向重復(fù)順序，作為蛋白結(jié)合位點；1、復(fù)制起始點（E.coli-oriC:245bp）GATTNTTTATTT···GATCTNTTNTATT···GATCCTTATTAG···11317293244···TGTGGATTA-‖-TTATTACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA5866