注射用微球內(nèi)部無菌檢查法探討

隨著制藥工業(yè)的發(fā)展，為適應(yīng)疾病的治療或預(yù)防需要而采用的藥物劑型層出不窮[1—2]。藥物與適宜載體(生物可降解材料)經(jīng)過一定的分散包埋技術(shù)制得的微米或納米級固態(tài)、液態(tài)或氣態(tài)藥物，包括微囊、微球、微晶、脂質(zhì)體和納米粒等，稱為微粒制劑，其中注射用微球是應(yīng)用最廣泛的微粒制劑之一。從國家藥品監(jiān)督管理局網(wǎng)站上可查詢到30余個(gè)注射用微球的進(jìn)口、國產(chǎn)品種的批準(zhǔn)文號，代表性品種有注射用醋酸亮丙瑞林微球、注射用利培酮微球、注射用醋酸奧曲肽微球、注射用全氟丁烷微球等。這些品種的質(zhì)量控制和分析方法備受關(guān)注，其中無菌檢查法的科學(xué)性和合理性是其關(guān)注的重要內(nèi)容。關(guān)于微粒制劑的質(zhì)量控制，美國藥典(USP42)<71>、歐洲藥典(EP11.0)<2.6.1>、日本藥典(JP18)<4.06>等均未單獨(dú)收載通用性技術(shù)要求的章節(jié)，僅在制劑通則中對處方設(shè)計(jì)和制備工藝進(jìn)行了介紹性說明，未涉及微生物檢查方法的特殊規(guī)定；美國注射劑協(xié)會(PDA)技術(shù)報(bào)告、人用藥品技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)理事會(ICH)指導(dǎo)原則中也未涉及相關(guān)規(guī)范性要求；《中華人民共和國藥典》2010年版(ChP2010)附錄首次收載《微球、微囊和脂質(zhì)體制劑指導(dǎo)原則》，ChP2015修訂為《微粒制劑指導(dǎo)原則》(通則9014)，一直沿用至ChP2020。通則9014中對于藥物載體類型、常用輔料載體和質(zhì)量控制的檢查項(xiàng)目等進(jìn)行了規(guī)定，但未對微生物質(zhì)量控制提出明確的技術(shù)要求[3]。目前，注射用微球品種標(biāo)準(zhǔn)中無菌項(xiàng)下規(guī)定主要分為3類。①指向通則，未規(guī)定具體操作方法，如：取本品，加所附的助懸劑制成混懸液，依照無菌檢查法進(jìn)行檢查，應(yīng)符合規(guī)定。②指向通則，規(guī)定了具體操作方法，如：取本品，每支按說明書，用所附的注射器和針頭，加入所附的溶劑使分散均勻，采用直接接種法，取每支全量接種至培養(yǎng)基50ml中，以金黃色葡萄球菌為陽性對照，依照無菌檢查法進(jìn)行檢查，應(yīng)符合規(guī)定。③規(guī)定分別進(jìn)行微球內(nèi)部和外部的無菌性檢查，如：取本品，分別溶解于相應(yīng)培養(yǎng)基2ml中，過濾，以金黃色葡萄球菌為陽性對照菌，進(jìn)行外部無菌檢查；取本品，分別溶解于無菌二甲基亞砜(DMSO)2ml中，過濾，且每膜過濾體積不超過10ml，以金黃色葡萄球菌為陽性對照菌，進(jìn)行內(nèi)部無菌檢查。注射用微球無菌檢查的難點(diǎn)聚焦在“球內(nèi)無菌”，即微球內(nèi)部的無菌性檢查[4]。一般而言，產(chǎn)品采用終端滅菌工藝，且粒度分布小于微生物污染物，生產(chǎn)工藝過程中微生物不易存在或不易存在于制劑內(nèi)部的，進(jìn)行微球外部無菌性檢查；產(chǎn)品采用無菌生產(chǎn)工藝，但粒度分布大于或類似于微生物污染物，在生產(chǎn)過程可能存在潛在污染風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，應(yīng)分別進(jìn)行微球內(nèi)部和外部的無菌性檢查。經(jīng)調(diào)研，大部分注射用微球采用無菌生產(chǎn)工藝，以聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)作為輔料[5—6]，與原料混合后，在密閉系統(tǒng)中包裹形成制劑，生產(chǎn)過程涉及二氯甲烷、乙酸等有機(jī)溶劑[7]，這種條件不利于微生物的生長和存活，但存在耐受性芽孢的污染風(fēng)險(xiǎn)。代表性品種(如注射用醋酸奧曲肽微球等)在進(jìn)行微球內(nèi)部無菌檢查時(shí)，采用DMSO作為溶劑制備供試液，但高濃度DMSO具有抑菌作用，是否影響無菌檢查方法的適用性和有效性尚待評估。此外，在某些品種(如注射用利培酮微球)的方法建立過程中，曾對其生產(chǎn)工藝各環(huán)節(jié)進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估，認(rèn)為涉及的無菌操作均在微球硬化之后，潛在的污染物僅可能存在于外表面，故在標(biāo)準(zhǔn)變更時(shí)取消了內(nèi)部無菌檢查。上述評估的規(guī)范性如何在藥品標(biāo)準(zhǔn)中進(jìn)行通用性技術(shù)規(guī)定，尚未進(jìn)行深入探討。本研究選擇注射用醋酸亮丙瑞林微球、注射用利培酮微球、注射用醋酸奧曲肽微球等國內(nèi)外代表性品種，聚焦微球內(nèi)部的無菌性檢查，考察供試液制備、試驗(yàn)用菌株、檢查方法等關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)的科學(xué)性和合理性，以期為注射用微球無菌檢查方法的建立和藥品標(biāo)準(zhǔn)的制定和修訂提供研究思路和數(shù)據(jù)支撐。Part1儀器與試藥

PhenomNano型掃描電鏡(荷蘭Phenom公司)；Supro150型濺射儀[復(fù)納科學(xué)儀器(上海)有限公司]；MIR254型恒溫培養(yǎng)箱(日本Panasonic公司)；FOM4/9型高壓蒸汽滅菌器(意大利Fedegari公司)；SteritestEquinox型集菌儀和Milliflex型薄膜過濾系統(tǒng)均購自德國Merck-Millipore公司。注射用醋酸亮丙瑞林微球(上海麗珠制藥有限公司)、注射用利培酮微球(瑞士Janssen-Cilag公司)、注射用奧曲肽微球(瑞士NovartisPharmaSchweiz公司)和注射用全氟丁烷微球(美國GEHealthCareAS公司)，上述產(chǎn)品均在有效期內(nèi)。硫乙醇酸鹽流體(FTM)培養(yǎng)基(批號VM859391903)、胰酪大豆胨液體(TSB)培養(yǎng)基(批號VM884759920)和胰酪大豆胨瓊脂(TSA)培養(yǎng)基(批號VM873358915)均購于德國MerckMillipore公司；沙氏葡萄糖液體(SDB)培養(yǎng)基(英國Oxoid公司，批號2202463)；沙氏葡萄糖瓊脂(SDA)培養(yǎng)基(批號1086835)和pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(批號1086984)均購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；0.1％無菌蛋白胨水溶液(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號20200812)；DMSO(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號20131225)；其他試劑均為分析純，水為滅菌純化水。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003]、大腸埃希菌(Escherichiacoli)[CMCC(B)44102]、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[CMCC(B)10104]、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)[CMCC(B)63501]、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)[CMCC(B)63202]、生孢梭菌(Clostridiumsporogenes)[CMCC(B)64941]、白念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001]、黑曲霉(Aspergillusniger)[CMCC(F)98003]等無菌檢查用標(biāo)準(zhǔn)菌株均為本實(shí)驗(yàn)室保藏。Part2方法與結(jié)果

2.1試驗(yàn)菌液的制備

參照ChP2020無菌檢查法(通則1101)，制備大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白念珠菌、黑曲霉和生孢梭菌的試驗(yàn)菌液；參照ChP2020抗生素微生物檢定法(通則1201)，制備枯草芽孢桿菌芽孢和短小芽孢桿菌芽孢的試驗(yàn)菌液。分別用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成每1ml含菌數(shù)為108cfu和不大于100cfu的菌懸液。2.2供試液的制備

DMSO供試液：取注射用微球粉末(裝量約為每瓶30mg)，每瓶加入DMSO溶液2ml，混勻。另取樣品，分別加入10％DMSO、25％DMSO、50％DMSO、75％DMSO溶液，均無法溶解形成均一的供試液。根據(jù)ChP2020通則1101關(guān)于供試液接種比例不大于培養(yǎng)基體積10％的規(guī)定，后續(xù)試驗(yàn)中分別采用100％DMSO(高濃度)、10％DMSO溶液(低濃度)，考察溶劑對試驗(yàn)菌生長的影響。水溶性供試液：精密稱取氯化銨2.7g，置500ml量瓶中，用水450ml溶解，量取三乙胺6.0ml加入瓶中，混勻，用水定容，用三乙胺調(diào)至pH10.0±0.1，制成pH10.0緩沖液，滅菌[8]。取注射用微球粉末(裝量約為每瓶30mg)，轉(zhuǎn)移至含上述滅菌緩沖液25ml的玻璃瓶中，密封，置45℃、120r/min的恒溫?fù)u床，至微球完全溶解。2.3方法適用性試驗(yàn)

參照ChP2020無菌檢查法(通則1101)配制相應(yīng)培養(yǎng)基，經(jīng)培養(yǎng)基的適用性和靈敏度檢查，符合藥典標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。方法適用性試驗(yàn)的設(shè)置共分為3組，其中空白對照組用于判定試驗(yàn)方法體系是否正常，溶劑組用于判定溶劑對試驗(yàn)方法是否有干擾，試驗(yàn)組用于判定試驗(yàn)方法是否符合規(guī)定。試驗(yàn)組：取注射用微球，加入相應(yīng)溶劑(DMSO或pH10.0緩沖液)，在上述溶液中分別加入含菌量不大于100cfu的試驗(yàn)菌液，混勻；將含有大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和生孢梭菌的混合溶液轉(zhuǎn)移至FTM培養(yǎng)基50ml中，于33℃培養(yǎng)不少于5d，將含有枯草芽孢桿菌、白念珠菌、黑曲霉、枯草芽孢桿菌芽孢和短小芽孢桿菌芽孢的混合溶液轉(zhuǎn)移至TSB培養(yǎng)基50ml中，于23℃培養(yǎng)不少于5d，觀察試驗(yàn)菌是否生長。溶劑對照組：取相應(yīng)溶劑(DMSO或pH10.0緩沖液)，加入含菌量不大于100cfu的試驗(yàn)菌液，混勻，其他同試驗(yàn)組操作?？瞻讓φ战M：取滅菌純化水，加入含菌量不大于100cfu的試驗(yàn)菌液，混勻，其他同試驗(yàn)組操作。2.4注射用微球的形態(tài)考察

分別取少量注射用微球，用小藥勺取出少許粉體或粉塊，均勻撒至石英玻璃臺上，使用一次性刻刀，反復(fù)、隨機(jī)刻切10次；將上述粉體或粉塊均勻撒至樣品臺導(dǎo)電膠上，使用洗耳球輕吹樣品表面，清理未黏附牢固的樣品，采用濺射儀(設(shè)置濺射功率20W，鍍金時(shí)間30s)處理，然后裝載入掃描電鏡(SEM)儀，根據(jù)不同的成像比例，設(shè)置加速電壓為5或10kV。分別以注射用醋酸亮丙瑞林微球、注射用利培酮微球和注射用醋酸奧曲肽微球?yàn)榭疾鞂ο驛—注射用醋酸亮丙瑞林微球(×2000，加速電壓5kV，比例尺30μm)；B—注射用利培酮微球(×2000倍，加速電壓5kV，比例尺30μm)；C—注射用醋酸奧曲肽微球(×2000倍，加速電壓10kV，比例尺30μm)；D—注射用醋酸亮丙瑞林微球(剖面圖，×5000倍，加速電壓10kV，比例尺10μm)；E—注射用利培酮微球(剖面圖，×6800倍，加速電壓5kV，比例尺10μm)；F—注射用醋酸奧曲肽微球(剖面圖，×2000倍，加速電壓10kV，比例尺30μm)。圖1注射用微球代表性品種的SEM照片結(jié)果顯示，3種微球均為實(shí)心球體，球面直徑為30～100μm；其中注射用醋酸亮丙瑞林微球?yàn)榉涓C狀實(shí)心球體，球體內(nèi)孔徑為1～3μm，球面和球內(nèi)的直徑均在微米級，與常見細(xì)菌的大小處于同數(shù)量級。雖然PLGA是緩釋或控釋制劑的常用輔料[6]，具有生物可降解性，但在無菌檢查供試液的常規(guī)制備時(shí)間內(nèi)無法完全溶解。2.5DMSO溶解微球后的無菌檢查方法適用性試驗(yàn)

2.5.1DMSO對試驗(yàn)菌生長抑制作用考察分別取“2.2”項(xiàng)下100％DMSO(高濃度)、10％DMSO溶液(低濃度)適量，依照ChP2020通則1101，分別加入不大于100cfu的各試驗(yàn)菌懸液，混勻。將含有大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和生孢梭菌的混合溶液轉(zhuǎn)移至FTM培養(yǎng)基50ml中，于33℃培養(yǎng)不少于5d，將含有枯草芽孢桿菌、白念珠菌、黑曲霉、枯草芽孢桿菌芽孢和短小芽孢桿菌芽孢的混合溶液轉(zhuǎn)移至TSB培養(yǎng)基50ml中，于23℃培養(yǎng)不少于5d。結(jié)果如表1所示，100％DMSO具有抑菌作用，藥典規(guī)定的試驗(yàn)菌(營養(yǎng)體)均無法生長；枯草芽孢桿菌芽孢和短小芽孢桿菌芽孢可以生長。10％DMSO溶液無抑菌作用，ChP2020規(guī)定的試驗(yàn)菌(營養(yǎng)體)和耐受性芽孢均可以生長，但微球無法溶解。注：1)每個(gè)單元格有5個(gè)正負(fù)號，依次顯示試驗(yàn)菌接種后d1至d5的生長情況：“–”表示無菌生長，“+”表示有菌生長。表1DMSO對試驗(yàn)菌生長的抑制作用1)2.5.2方法適用性試驗(yàn)分別選擇注射用醋酸亮丙瑞林微球和注射用利培酮微球2個(gè)代表性品種，進(jìn)行微球內(nèi)部無菌檢查的方法適用性試驗(yàn)。取上述樣品，每瓶用DMSO溶液2ml溶解微球，以此作為供試液。供試液冷凍干燥后鏡檢，結(jié)果顯示SEM視野下未見完整的微球形態(tài)，提示輔料已被DMSO溶液溶解。依照ChP2020通則1101，在注射用微球與DMSO溶液混合后，分別加入不大于100cfu的各試驗(yàn)菌懸液，混勻。將含有大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和生孢梭菌的混合溶液轉(zhuǎn)移至FTM培養(yǎng)基50ml中，于33℃培養(yǎng)不少于5d，將含有枯草芽孢桿菌、白念珠菌、黑曲霉、枯草芽孢桿菌芽孢和短小芽孢桿菌芽孢的混合溶液轉(zhuǎn)移至TSB培養(yǎng)基50ml，于23℃培養(yǎng)不少于5d，作為試驗(yàn)組；同時(shí)，以滅菌純化水作為空白對照組、100％DMSO作為試劑對照組，同法操作。結(jié)果如表2所示。100％DMSO可溶解上述2個(gè)品種的注射用微球，但“2.5.1”項(xiàng)下結(jié)果顯示100％DMSO對于藥典規(guī)定的試驗(yàn)菌(營養(yǎng)體)的生長均具有抑制作用，因此可選擇枯草芽孢桿菌芽孢和短小芽孢桿菌芽孢作為試驗(yàn)菌，進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。10％DMSO溶液雖然未見對于藥典規(guī)定的試驗(yàn)菌(營養(yǎng)體)的生長抑制作用，但其無法溶解微球制成供試液。結(jié)果提示，以上2個(gè)注射用微球代表性品種的內(nèi)部無菌性檢查可采用100％DMSO作為溶劑制備供試液，結(jié)合生產(chǎn)工藝過程中潛在污染的風(fēng)險(xiǎn)評估，以耐受性芽孢作為試驗(yàn)菌，進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。2.6水溶性緩沖液溶解微球后的無菌檢查方法適用性試驗(yàn)

根據(jù)注射劑的應(yīng)用情況，無菌檢查一般制備水溶性供試液，通過薄膜過濾法進(jìn)行無菌性檢查。DMSO為有機(jī)溶劑，且對營養(yǎng)體狀態(tài)的試驗(yàn)菌的生長具有抑制作用，為尋求水溶性的“破球”方法，通過模擬注射用微球的體外釋放度，制備水溶性供試液。由于PLGA輔料的酯鍵斷裂后產(chǎn)酸，調(diào)節(jié)緩沖體系pH值至堿性，可加速輔料降解[8—9]。2.6.1pH10.0緩沖液對試驗(yàn)菌生長抑制作用的考察取“2.2”項(xiàng)下pH10.0緩沖液適量，依照ChP2020通則1101，分別加入不大于100cfu的各試驗(yàn)菌，混勻。將含有大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和生孢梭菌的混合溶液轉(zhuǎn)移至FTM培養(yǎng)基50ml中，于33℃培養(yǎng)不少于5d；將含有枯草芽孢桿菌、白念珠菌、黑曲霉、枯草芽孢桿菌芽孢和短小芽孢桿菌芽孢的混合溶液轉(zhuǎn)移至TSB培養(yǎng)基50ml中，于23℃培養(yǎng)不少于5d。同時(shí)，為確證pH10.0緩沖液中試驗(yàn)菌株的穩(wěn)定性，另取適量pH10.0緩沖液，加入試驗(yàn)菌后，置45℃、120r/min的恒溫?fù)u床中孵育4～6h，然后分別轉(zhuǎn)移至不同培養(yǎng)基，觀察菌株生長情況。將上述采用新鮮配制pH10.0緩沖液的試驗(yàn)組作為溶劑試驗(yàn)組1，采用經(jīng)孵育4～6h的pH10.0緩沖液的試驗(yàn)組作為溶劑試驗(yàn)組2。表3pH10.0緩沖溶液對試驗(yàn)菌生長的抑制作用1)結(jié)果如表3所示，依照ChP2020通則1101的試驗(yàn)步驟，pH10.0緩沖液對藥典規(guī)定的試驗(yàn)菌(營養(yǎng)體)、枯草芽孢桿菌芽孢和短小芽孢桿菌芽孢的生長均無影響；但當(dāng)溫度升高、振蕩增加、緩沖液經(jīng)孵育處理時(shí)，試驗(yàn)菌株的生長狀態(tài)不穩(wěn)定，僅耐受性芽孢可以生長。2.6.2方法適用性試驗(yàn)分別選擇注射用醋酸亮丙瑞林微球和注射用奧曲肽微球2個(gè)代表性品種，進(jìn)行無菌檢查方法適用性試驗(yàn)。取上述樣品，每瓶轉(zhuǎn)移至含pH10.0緩沖液25ml的玻璃瓶中，于45℃、120r/min密封無菌狀態(tài)下孵育4～6h，獲得供試液(同時(shí)以pH4.0、pH7.0緩沖液作為對照，相同條件下微球均無法溶解，加速釋放行為與相關(guān)研究結(jié)果一致[9])。供試液冷凍干燥后鏡檢，SEM視野下未見完整的微球形態(tài)，提示輔料能夠在此條件下加速降解。依照ChP2020通則1101，在注射用微球與pH10.0緩沖液混合后，分別加入不大于100cfu的各試驗(yàn)菌懸液，混勻，在上述條件下孵育至微球完全溶解。將含有大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和生孢梭菌的混合溶液轉(zhuǎn)移至FTM培養(yǎng)基225ml中，于33℃培養(yǎng)不少于5d；將含有枯草芽孢桿菌、白念珠菌、黑曲霉、枯草芽孢桿菌芽孢和短小芽孢桿菌芽孢的混合溶液轉(zhuǎn)移至TSB培養(yǎng)基225ml中，于23℃培養(yǎng)不少于5d，作為試驗(yàn)組；同時(shí)，以滅菌純化水作為空白對照組、以pH10.0緩沖液作為試劑對照組，同法操作。結(jié)果如表4所示，上述2個(gè)品種的注射用微球在45℃、pH10.0堿性環(huán)境下振蕩孵育，輔料可加速降解以制備供試液進(jìn)行無菌檢查，由于此條件下藥典規(guī)定的試驗(yàn)菌(營養(yǎng)體)生長狀態(tài)不穩(wěn)定，且由于生孢梭菌為嚴(yán)格厭氧菌，在有氧環(huán)境下無法生長(見表4空白對照組)，因此可選擇枯草芽孢桿菌芽孢和短小芽孢桿菌芽孢作為試驗(yàn)菌，進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。Part3討論

本研究在調(diào)研注射用微球生產(chǎn)工藝和產(chǎn)品注冊申報(bào)資料的基礎(chǔ)上，選擇注射用醋酸亮丙瑞林微球等代表性品種，建立了2種無菌檢查方法：一是采用DMSO溶解微球；二是采用pH10.0水溶性緩沖液加速輔料降解后溶解微球。制備的無菌檢查供試液依照ChP2020通則1101，以枯草芽孢桿菌芽孢或短小芽孢桿菌芽孢作為試驗(yàn)菌，采用直接接種法進(jìn)行無菌檢查?；谧⑸溆梦⑶虻奶攸c(diǎn)，該制劑無菌檢查主要關(guān)注以下技術(shù)環(huán)節(jié)。①在充分了解產(chǎn)品生產(chǎn)工藝、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、過程控制中微生物污染關(guān)鍵環(huán)節(jié)的基礎(chǔ)上，經(jīng)方法驗(yàn)證及相關(guān)方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)后，建立無菌檢查方法；例如，目前絕大部分注射用微球產(chǎn)品采用無菌生產(chǎn)工藝，微球內(nèi)部不易有微生物營養(yǎng)體存活，可采用枯草芽孢桿菌芽孢或短