原核表達(dá)條件優(yōu)化

專題討論】原核表達(dá)條件優(yōu)化！之所以首先介紹Novagen公司的產(chǎn)品是因為用過它的pET系列載體，感覺很好用。Novagen的母公司是德國默克(Merck)公司，它是國際著名的化學(xué)及制藥公司總部位于德國的Darmstadt，已有300多年的歷史。已在全世界55個主要國家設(shè)立了分公司，其中在28個國家建有62個生產(chǎn)基地。Novagen公司出品的pET系列載體是目前應(yīng)用最為廣泛的原核表達(dá)系統(tǒng)，已經(jīng)成功地在大腸桿菌中表達(dá)了各種各樣的異源蛋白。pET系列載體是利用大腸桿菌T7噬菌體轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)的載體，其表達(dá)原理見下圖。T7噬菌體具有一套專一性非常強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄體系，利用這一體系中的元件為基礎(chǔ)構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)稱為T7表達(dá)系統(tǒng)。T7噬菌體基因編碼的T7RNA聚合酶選擇性的激活T7噬菌體啟動子的轉(zhuǎn)錄。它是一種高活性的RNA聚合酶，其合成mRNA的速度比大腸桿菌RNA聚合酶快5倍左右。并可以轉(zhuǎn)錄某些不能被大腸桿菌RNA聚合酶有效轉(zhuǎn)錄的序列。在細(xì)胞中存在T7RNA聚合酶和T7噬菌體啟動子的情形下，大腸桿菌宿主本身基因的轉(zhuǎn)錄競爭不過T7噬菌體轉(zhuǎn)錄體系，最終受T7噬菌體啟動子控制的基因的轉(zhuǎn)錄能達(dá)到很高的水平。T7噬菌體啟動子的轉(zhuǎn)錄完全依賴于T7RNA聚合酶，因此T7RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式就決定了表達(dá)系統(tǒng)的調(diào)控方式。噬菌體DE3是久噬菌體的衍生株，一段含有l(wèi)acl,lacUV5啟動子和T7RNA聚合酶基因的DNA片段倍插入其int基因中，用噬菌體DE3的溶源菌，如BL21(DE3)、HMS174(DE3)等作為表達(dá)載體的宿主菌，調(diào)控方式為化學(xué)信號誘導(dǎo)型，類似于Lac表達(dá)系統(tǒng)。從開始涉及表達(dá)的時候可以根據(jù)是否要用基因本身的起始密碼子進(jìn)行選擇,Novagen公司僅提供三個載體:pET-21(+)，pET-24(+)和pET-23(+)。如果你打算利用載體的起始密碼子，那么就有許多選擇。根據(jù)是否要可溶性表達(dá)，選擇加有不同標(biāo)記的載體。一般說來在大腸桿菌中不加標(biāo)記外源蛋白都會以不溶的包涵體形式表達(dá)。為了讓外源蛋白融合表達(dá)一般說來有三個策略:與一個高度可溶的多肽聯(lián)合一起表達(dá)，比如：谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(glutathioneStransferase,GST)、硫氧還蛋白(thioredoxin,Trx)和N利用質(zhì)A(NutilizationsubstanceA,NusA）。轉(zhuǎn)入一個酶催化二硫鍵的形成，如：硫氧還蛋白，DsbA,DsbC。插入一個定位到周質(zhì)空間的信號序列。不同載體提供不同的標(biāo)記，有的可以同時帶有多個標(biāo)記。如果你不希望在蛋白的N末端加入任何的多肽，你也可以選擇用Ndel直接從起始密碼子后插入外源片斷，或者在得到表達(dá)產(chǎn)物后利用蛋白氨基酸的酶切位點(diǎn)把多余的多肽切除。在重組技術(shù)上，Novagen除了傳統(tǒng)的酶切、連接方式外，還有不需要連接的克隆方式：Ligation-Independentcloning，簡稱LIC。采用LIC方法的pET載體是線性化的，在末端有12-15個突出的堿基以在退火時和目的片斷互補(bǔ)。在設(shè)計PCR擴(kuò)增引物時加入與LIC載體互補(bǔ)的序列，PCR產(chǎn)物用3'—5'的內(nèi)切酶消化出單鏈與載體互補(bǔ)的序列。通過這種方式就可以把目的片斷定向、高效地插入LIC載體上。一般的pET載體是先在不含DE3片段的菌株中進(jìn)行克隆篩選，之后再把陽性克隆轉(zhuǎn)化進(jìn)入表達(dá)菌株，如BL21(DE3)中，通過IPTG誘導(dǎo)進(jìn)行表達(dá)。而pETcoco載體它引入了低拷貝控制元件，F(xiàn)附加體上的oriS和repE元件與parABC共同作用下使質(zhì)粒在細(xì)菌中保持單拷貝，這樣即可以使質(zhì)粒在細(xì)菌內(nèi)穩(wěn)定存在又可以減少外源蛋白對細(xì)胞的毒害作用。當(dāng)我們需要大量表達(dá)時加入樹膠醛醣誘導(dǎo)trfA基因表達(dá)，質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)就可以增加到25-50。pETcoco載體同時兼容了DE3調(diào)控模型，在加入IPTG后誘導(dǎo)表達(dá)量達(dá)升高2500倍。在保證質(zhì)粒穩(wěn)定性這一點(diǎn)上除了pETcoco的方法還有另一種方法就是將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入含有T7RNA聚合酶抑制劑的T7溶菌酶表達(dá)基因的菌株中，在含有pLysS的pLysE宿主菌內(nèi)重組質(zhì)粒的本底表達(dá)被進(jìn)一步抑制，質(zhì)?？梢愿€(wěn)定地存在。Novagen提供多種表達(dá)使用的菌株，為了提高表達(dá)量做出了各種改造，它們大致分為以下幾個種類：蛋白酶缺陷型所有B菌株的衍生株都是lon蛋白酶和ompT蛋白酶缺陷型的，這包括有B834,BL21,BLR,Origami?B,Rosetta?和Tuner?。因此在純化時可以保持蛋白的穩(wěn)定不被降解。BL21(DE3)是應(yīng)用最多的表達(dá)的表達(dá)菌株。另外它的衍生株BLR(DE3)是recA—,RecA是大腸桿菌中介導(dǎo)同源重組的重要蛋白之一。它的缺失，可以保證質(zhì)粒的穩(wěn)定。保證所有細(xì)胞以同樣量進(jìn)行表達(dá)Tuner?株及它的衍生株(0rigami?B和Rosetta?)是BL21菌株的lacYl缺失突變型，在這些菌株中可以使蛋白以同樣水平在所有細(xì)胞中表達(dá)。Lac滲透酶的突變使進(jìn)入每個細(xì)胞的IPTG量都是一致的，這樣使蛋白表達(dá)濃度可以隨著IPTG濃度而改變。通過對IPTG濃度的控制可以使細(xì)胞微量表達(dá)或者大量表達(dá)。一般說來，低濃度表達(dá)有利于蛋白的可溶性和活性。二硫鍵形成與溶解性增強(qiáng)二硫鍵的形成對某些蛋白的可溶性起到重要的作用，而Novagen也專門設(shè)計了一些菌株是谷胱甘肽還原酶（gor）和/或硫氧還蛋白還原酶（trxB）缺陷型的，包括AD494，BL21trxB，Origami，OrigamiB和Rosetta-gami?。在這些菌株中表達(dá)蛋白，可以更大程度促進(jìn)二硫鍵的形成，并使蛋白以可溶形式和有活性形式出現(xiàn)的可能增加。稀有密碼子的補(bǔ)給不同物種有不同的密碼子偏愛性，如果外源蛋白中含大量大腸桿菌的稀有密碼子，特別當(dāng)這些稀有密碼子呈連續(xù)分布的時候，就會造成蛋白表達(dá)量極低，或者翻譯提前終止°Rosetta?是為了表達(dá)真核蛋白而特別設(shè)計的，它含有大腸桿菌稀有的密碼子tRNA，包括AUA，AGG，AGA，CUA，CCC和GGA。它們以氯霉素抗性的質(zhì)粒形式存在。Rosetta系列是來自BL21lacYl，所以它具有BL21lacYl的所有特性。硒蛋氨酸標(biāo)記B834是來源于BL21的蛋氨酸（met）營養(yǎng)缺陷型菌株。它在高度特異活性35S-met標(biāo)記和晶體成像蛋氨酸標(biāo)記中非常有用。我們常用的培養(yǎng)基有LB、TB、M9、M9ZB,LB因為其成本低廉所以應(yīng)用最為廣泛，而Novagen有提供特殊的培養(yǎng)基OvernightExpress?AutoinductionSystem。使用這種培養(yǎng)基不需要按照傳統(tǒng)方法先培養(yǎng)一段時間再加IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，它可以直接進(jìn)行過夜培養(yǎng)。在這種培養(yǎng)基中含有痕量金屬，可以滿足合成蛋白時對金屬的需求。同時提供除了各種氨基酸，這其中蛋氨酸是另外加入的。這樣培養(yǎng)基可以滿足細(xì)菌生長的各種需求，使細(xì)菌密度更高；可以自動誘導(dǎo)無需自己加IPTG；使蛋白更加容易溶于培養(yǎng)基中；并且如果需要的話，可以對蛋氨酸進(jìn)行硒標(biāo)記。同時Novagen還有表達(dá)雙外源蛋白的載體pCDFDuetTDNA、pETDuet?TDNA、pRSFDuetTDNA。這些載體含有兩個不同多克隆位點(diǎn)，可以插入兩個外源蛋白基因，利用單獨(dú)的T7啟動子，乳糖操縱子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行表達(dá)。載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入合適的菌株中最多可以同時表達(dá)8個外源蛋白。人們合成與生物相關(guān)的物質(zhì)是從尿素開始的，1828年，德國化學(xué)家維勒人工合成了存在于生物體的這種有機(jī)物。在1960年我國科學(xué)家采用化學(xué)方法首次成功地合成了具有生物活性的蛋白質(zhì)——胰島素。隨著內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和基因工程技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)用各種不同的載體在原核、真核系統(tǒng)中進(jìn)行蛋白表達(dá)更為行之有效。而這其中大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)發(fā)展得最為迅速、成熟。原核表達(dá)具有操作方便、快捷，需時較短，表達(dá)量大，適合工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。雖然也有缺少糖基化和表達(dá)后加工等問題，當(dāng)有了其它多種表達(dá)系統(tǒng)后，原核系統(tǒng)仍是我們合成外源蛋白的首選。在網(wǎng)上看到有人把原核表達(dá)技術(shù)分成四個等級：初次嘗試掃盲、亂棍打棗入門、系統(tǒng)優(yōu)化中級和自成一體高手，覺得十分有意思。但是根據(jù)筆者自己的經(jīng)驗以及耳聞目睹的一些經(jīng)歷告訴我：做表達(dá)？那是謀事在人，成事在天。有時候你把克隆做出來了，雙酶切鑒定沒問題，測序沒問題，可是就是看不到表達(dá)帶。原因當(dāng)然可以分析，實驗也是可以改進(jìn)，但是竄改一下戈爾泰的話：“成功的實驗都是一樣的，失敗的實驗各有各的不幸。”在實驗遇到瓶頸的時候要如何進(jìn)行分析，找到問題的癥結(jié)是我們的實驗關(guān)鍵所在。在準(zhǔn)備進(jìn)行原核表達(dá)的時候需要考慮的因素很多，市面上可供選擇的載體、菌株也很多，要如何進(jìn)行正確的選擇，找到適合自己的載體是十分重要的。所以，現(xiàn)在要對目前常用的一些載體進(jìn)行介紹，讓我們對其相關(guān)產(chǎn)品及其表達(dá)原理進(jìn)行了解，以方便實驗設(shè)計。首先來一些大腸桿菌表達(dá)的基本概念：一個完整的表達(dá)系統(tǒng)通常包括配套的表達(dá)載體和表達(dá)菌株，如果是特殊的誘導(dǎo)表達(dá)還包括誘導(dǎo)劑，如果是融合表達(dá)還包括純化系統(tǒng)或者Tag檢測等等。選擇表達(dá)系統(tǒng)通常要根據(jù)實驗?zāi)康膩砜紤]，比如表達(dá)量高低，目標(biāo)蛋白的活性，表達(dá)產(chǎn)物的純化方法等等。主要?dú)w結(jié)在表達(dá)載體的選擇上。表達(dá)載體：我們關(guān)心的質(zhì)粒上的元件包括啟動子，多克隆位點(diǎn)，終止密碼，融合Tag（如果有的話），復(fù)制子，篩選標(biāo)記/報告基因等。通常，載體很貴，我們可以通過實驗室之間交換得到免費(fèi)的載體。但是要小心,輾轉(zhuǎn)多個實驗室和多個實驗室成員之手的載體是否保持原來的遺傳背景？MCS是否還是原來那個MCS?是我們要特別注意的。復(fù)制子:通常表達(dá)載體都會選用高拷貝的復(fù)制子°pSC101類質(zhì)粒是嚴(yán)謹(jǐn)方式復(fù)制，拷貝數(shù)低,pCoEl,pMBI（pUC）類的復(fù)制子的拷貝數(shù)高達(dá)500以上，是表達(dá)載體常用的。通常情況下質(zhì)粒拷貝數(shù)和表達(dá)量是非線性的正相關(guān)，當(dāng)然也不是越多越好，超過細(xì)胞的承受范圍反而會損害細(xì)胞的生長。如果碰巧需要2個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化，就要考慮復(fù)制元是否相容的問題。篩選標(biāo)記和報告基因：氨芐青霉素抗性是最常見的篩選標(biāo)記，卡那霉素或者是新霉素次之，通常是另一個載體的篩選標(biāo)記用。四環(huán)素，紅霉素和氯霉素等已經(jīng)日漸式微?？剐曰虻倪x擇要注意是否會對研究對象產(chǎn)生干擾，比如代謝研究中要留意抗性基因編碼的酶是否和代謝物相互作用。在表達(dá)篩選中要注意的問題應(yīng)該就是LB倒板前加抗生素的溫度，溫度過高容易導(dǎo)致抗生素失效。今天耐青霉素的超級細(xì)菌泛濫，不知道是否有我們實驗人員的功勞呢？大家“隨便倒掉”已經(jīng)獲得氨芐抗性的大腸桿菌之前有沒有經(jīng)過煮沸或者消毒等處理呢？從以前的一針50萬單位到現(xiàn)在100多萬個單位，青霉素劑量似乎越來越大了。對于做表達(dá)來說，如果不是要研究啟動子的強(qiáng)弱，通常比較少關(guān)心或者用到報告基因吧。綠色熒光蛋白是最常用的報告基因了（注意選擇適用原核表達(dá)版本的GFP），其他還有半乳糖苷酶啊，熒光素酶啊等等。一些融合表達(dá)Tag也有報告基因的功能。啟動子、終止子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)啟動子：啟動子的強(qiáng)弱是對表達(dá)量有決定性影響的因素之一。從轉(zhuǎn)錄模式上看有組成型表達(dá)和誘導(dǎo)調(diào)控型表達(dá)。lac和Tac,PL和PR,T7是最常用的啟動子，生物通在下面和后繼的文章中會逐一介紹組成型表達(dá)：表達(dá)載體的啟動子為組成型啟動子，也就是一直努力不停表達(dá)目的蛋白的啟動子，如pMAL系統(tǒng)。持續(xù)性表達(dá)通常表達(dá)量比較高,成本低,但是不適合表達(dá)一些對宿主細(xì)菌生長有害的蛋白。因為過量或者有害的表達(dá)產(chǎn)物會影響細(xì)菌的生長,反過來影響表達(dá)量的積累。誘導(dǎo)調(diào)控型表達(dá)：表達(dá)載體采用誘導(dǎo)型啟動子,只有在誘導(dǎo)劑存在的條件下才能表達(dá)目的產(chǎn)物。這種方法有助于避免菌體生長前期高表達(dá)對菌體生長的影響,又可減少菌體蛋白酶對目標(biāo)產(chǎn)物的降解。特別適合解決有毒蛋白的表達(dá)。另外也有啟動子是組成型的,但是啟動子所依賴的轉(zhuǎn)錄酶是誘導(dǎo)表達(dá)的,也屬于誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。融合表達(dá)：表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)上有一段融合表達(dá)標(biāo)簽（Tag），表達(dá)產(chǎn)物為融合蛋白（有分N端或者C端融合表達(dá)），方便后繼的純化步驟或者檢測。對于特別小的分子建議用較大的Tag（如GST）以獲得穩(wěn)定表達(dá)；而一般的基因多選擇小Tag以減少對目的蛋白的影響。His-Tag是最廣泛采用的Tag。分泌表達(dá)：在起始密碼和目的基因之間加入信號肽，可以引導(dǎo)目的蛋白穿越細(xì)胞膜，避免表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的過度累積而影響細(xì)胞生長，或者形成包含體，而且表達(dá)產(chǎn)物是可溶的活性狀態(tài)不需要復(fù)性。通常這種分泌只是分泌到細(xì)胞膜和細(xì)胞壁之間的周質(zhì)空間。可溶性表達(dá)：大腸桿菌表達(dá)效率很高，特別是強(qiáng)啟動子，目的蛋白來不及折疊而形成不溶的包含體顆粒，包含體容易純化但是復(fù)性效率不高。分泌表達(dá)可以得到可溶的產(chǎn)物，也有部分融合Tag有助于提高產(chǎn)物的可溶性，比如Thio，pMAL系統(tǒng)。轉(zhuǎn)錄終止子對外源基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)有重要作用一一控制轉(zhuǎn)錄的RNA長度提高穩(wěn)定性，避免質(zhì)粒上異常表達(dá)導(dǎo)致質(zhì)粒穩(wěn)定性下降。放在啟動子上游的轉(zhuǎn)錄終止子還可以防止其他啟動子的通讀，降低本底。轉(zhuǎn)錄終止子有兩類，Rho因子作用下使轉(zhuǎn)錄終止mRNA和根據(jù)模版上的對稱序列形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)而終止mRNA。常見的是rrnBrRNA操縱子的T1T2串連轉(zhuǎn)錄終止子。核糖體結(jié)合位點(diǎn)：啟動子下游從轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)開始延伸的一段堿基序列，其中能與rRNA16S亞基3'端互補(bǔ)的SD序列對形成翻譯起始復(fù)合物是必需的，多數(shù)載體啟動子下游都有SD序列，也有些載體沒有，適合自帶SD序列的基因表達(dá)，要留意。表達(dá)菌株：我們往往最容易忽視的一點(diǎn)。不同的表達(dá)載體對應(yīng)有不同的表達(dá)菌株，一些特別設(shè)計的菌株更有助于解決一些表達(dá)難題，這一點(diǎn)生物通會有專門的介紹。同樣的，交換獲得的免費(fèi)菌株，要小心其遺傳背景是否已經(jīng)發(fā)生改變？當(dāng)心。注：以上各種特性是可以相互組合的，不是排他的！幾個常用的啟動子和誘導(dǎo)調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)最早應(yīng)用于的表達(dá)系統(tǒng)是Lac乳糖操縱子，由啟動子Plac+操縱基因lacO+結(jié)構(gòu)基因組成。其轉(zhuǎn)錄受CAP正調(diào)控和lacl負(fù)調(diào)控。lacUV5突變能夠在沒有CAP的存在下更有效地起始轉(zhuǎn)錄，該啟動子在轉(zhuǎn)錄水平上只受lacI的調(diào)控，因而隨后得到了更廣泛采用。lacI產(chǎn)物是一種阻遏蛋白，能結(jié)合在操縱基因lacO上從而阻遏轉(zhuǎn)錄起始。乳糖的類似物IPTG可以和lacI產(chǎn)物結(jié)合，使其構(gòu)象改變離開lacO，從而激活轉(zhuǎn)錄。這種可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控成為了大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)載體構(gòu)建的常用元件。tac啟動子是trp啟動子和lacUV5的拼接雜合啟動子，且轉(zhuǎn)錄水平更高，比lacUV5更優(yōu)越。trc啟動子是trp啟動子和lac啟動子的拼合啟動子，同樣具有比trp更高的轉(zhuǎn)錄效率和受lacI阻遏蛋白調(diào)控的強(qiáng)啟動子特性。在常規(guī)的大腸桿菌中，lacl阻遏蛋白表達(dá)量不高，僅能滿足細(xì)胞自身的lac操縱子，無法應(yīng)付多拷貝的質(zhì)粒的需求，導(dǎo)致非誘導(dǎo)條件下較高的本底表達(dá)，為了讓表達(dá)系統(tǒng)嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控產(chǎn)物表達(dá)，能過量表達(dá)lacI阻遏蛋白的laclq突變菌株常被選為Lac/Tac/trc表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)菌株。現(xiàn)在的Lac/Tac/trc載體上通常還帶有l(wèi)acIq基因，以表達(dá)更多l(xiāng)acI阻遏蛋白實現(xiàn)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)恼T導(dǎo)調(diào)控。IPTG廣泛用于誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，但是IPTG有一定毒性，有人認(rèn)為在制備醫(yī)療目的的重組蛋白并不合適，因而也有用乳糖代替IPTG作為誘導(dǎo)物的研究。另外一種研究方向是用lacI的溫度敏感突變體，30度下抑制轉(zhuǎn)錄，42度開發(fā)。熱誘導(dǎo)不用添加外來的誘導(dǎo)物，成本低，但是由于發(fā)酵過程中加熱升溫比較慢而影響誘導(dǎo)效果，而且熱誘導(dǎo)本身會導(dǎo)致大腸桿菌的熱休克蛋白激活，一些蛋白酶會影響產(chǎn)物穩(wěn)定。以入噬菌體再起轉(zhuǎn)錄啟動子PL、PR構(gòu)建的載體也為大家所熟悉。這兩個強(qiáng)啟動子受控于入噬菌體cI基因產(chǎn)物。cI基因的溫度敏感突變體cI857(ts)常常被用于調(diào)控PL、PR啟動子的轉(zhuǎn)錄。同樣也是30度下阻遏啟動子轉(zhuǎn)錄，42度下解除抑制開發(fā)轉(zhuǎn)錄。同樣的，PL、PR表達(dá)載體需要攜帶cI857(ts)菌株作為表達(dá)載體，現(xiàn)在更常見的做法是在載體上攜帶cI857(ts)基因，所以可以有更大的宿主選擇范圍。另外一種思路是通過嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控cI產(chǎn)物來間接調(diào)控PL、PR啟動子的轉(zhuǎn)錄。比如Invitrogen的PL表達(dá)系統(tǒng)，就是將受trp啟動子嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控的cI基因溶源化到宿主菌染色體上，通過加入酪氨酸誘導(dǎo)抑制trp啟動子，抑制cI基因的表達(dá)，從而解除強(qiáng)大的PL啟動子的抑制。T7啟動子是當(dāng)今大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的主流，這個功能強(qiáng)大兼專一性高的啟動子經(jīng)過巧妙的設(shè)計而成為原核表達(dá)的首選，尤其以Novagen公司的pET系統(tǒng)為杰出代表。強(qiáng)大的T7啟動子完全專一受控于T7RNA聚合酶，而高活性的T7RNA聚合酶合成mRNA的速度比大腸桿菌RNA聚合酶快5倍——當(dāng)二者同時存在時，宿主本身基因的轉(zhuǎn)錄競爭不過T7表達(dá)系統(tǒng)，幾乎所有的細(xì)胞資源都用于表達(dá)目的蛋白；誘導(dǎo)表達(dá)后僅幾個小時目的蛋白通?？梢哉嫉郊?xì)胞總蛋白的50%以上。由于大腸桿菌本身不含T7RNA聚合酶，需要將外源的T7RNA聚合酶引入宿主菌，因而T7RNA聚合酶的調(diào)控模式就決定了T7系統(tǒng)的調(diào)控模式——非誘導(dǎo)條件下，可以使目的基因完全處于沉默狀態(tài)而不轉(zhuǎn)錄，從而避免目的基因毒性對宿主細(xì)胞以及質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響；通過控制誘導(dǎo)條件控制T7RNA聚合酶的量，就可以控制產(chǎn)物表達(dá)量，某些情況下可以提高產(chǎn)物的可溶性部分。有何高招？且看生物通為你一一道來：有幾種方案可用于調(diào)控T7RNA聚合酶的合成，從而調(diào)控T7表達(dá)系統(tǒng)。噬菌體DE3是lambda噬菌體的衍生株，含有l(wèi)acI抑制基因和位于lacUV5啟動子下的T7RNA聚合酶基因。DE3溶源化的菌株如BL21(DE3)就是最常用的表達(dá)菌株，構(gòu)建好的表達(dá)載體可以直接轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株中，誘導(dǎo)調(diào)控方式和lac一樣都是IPTG誘導(dǎo)。另一種策略是用不含T7RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因，即可完全避免因目的蛋白對宿主細(xì)胞的潛在毒性而造成的質(zhì)粒不穩(wěn)定。然后用ACE6噬菌體侵染宿主細(xì)胞——CE6是lambda噬菌體含溫度敏感突變(cI857ts)和pL/pR啟動子控制T7RNA聚合酶的衍生株，在熱誘導(dǎo)條件下可以激活T7RNA聚合酶的合成。此了噬菌體之外，還可以通過共轉(zhuǎn)化質(zhì)粒提供T7RNA聚合酶。比如有人用受溶氧濃度控制的啟動子調(diào)控T7RNA聚合酶合成，據(jù)說這比較適合工業(yè)化發(fā)酵的條件控制。由于T7RNA聚合酶的調(diào)控方式仍有可能有痕量的本底表達(dá)，控制基礎(chǔ)表達(dá)的手段之一是培養(yǎng)基外加葡萄糖,有助于控制本底表達(dá)水平。2?是采用帶有T7lac啟動子的載體——在緊鄰T7啟動子的下游有一段lacI操縱子序列編碼表達(dá)lac阻遏蛋白(lacI)，lac阻遏蛋白可以作用于宿主染色體上T7RNA聚合酶前的lacUV5啟動子并抑制其表達(dá)，也作用于載體T7lac啟動子，以阻斷任何T7RNA聚合酶導(dǎo)致的目的基因轉(zhuǎn)錄。pLacI工轉(zhuǎn)化也是同樣的原理。如果這還不夠，更為嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控手段還有——在宿主菌中表達(dá)另一個可以結(jié)合并抑制T7RNA聚合酶的基因——T7融菌酶，降低本底。常用的帶溶菌酶質(zhì)粒有pLysS和pLysE，相容的ori都不會影響后繼的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，前者表達(dá)的溶菌酶的水平要比后者低得多，對細(xì)胞生長影響小，而pLysE會明顯降低宿主菌的生長水平，容易出現(xiàn)過度調(diào)節(jié)，增加蛋白表達(dá)的滯后時間，從而降低表達(dá)水平。通過幾種不同方法來巧妙調(diào)控T7聚合酶合成，T7啟動子發(fā)展出了史上功能最強(qiáng)大，最豐富的表達(dá)系統(tǒng)。生物通在下面首先進(jìn)行主流表達(dá)系統(tǒng)介紹：了解各種產(chǎn)品的特色，是選擇合適的表達(dá)系統(tǒng)的關(guān)鍵哦。優(yōu)化基因表達(dá)的關(guān)鍵因素之：基因的重新設(shè)計和合成密碼子最佳化(codonoptimization)遺傳密碼有64種，但是絕大多數(shù)生物傾向于利用這些密碼子中的一部分。那些被最頻繁利用的稱為最佳密碼子(optimalcodons)，那些不被經(jīng)常利用的稱為稀有或利用率低的密碼子(rareorlow-usagecodons)。實際上用做蛋白表達(dá)或生產(chǎn)的每種生物(包括大腸桿菌，酵母，哺乳動物細(xì)胞，Pichia，植物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞)都表現(xiàn)出某種程度的密碼子利用的差異或偏愛。大腸桿菌、酵母、果蠅、靈長類等每種生物都有獨(dú)特的8個密碼子極少被利用［1］。有趣的是，靈長類和酵母有6個同樣的利用率低的密碼子。大腸桿菌、酵母和果蠅中編碼豐度高的蛋白質(zhì)的基因明顯避免低利用率的密碼子。因此，重組蛋白的表達(dá)可能受密碼子利用的影響（尤其在異源表達(dá)系統(tǒng)中）的事實并不很奇怪。你的基因利用的密碼子可能不是你正在利用的蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)進(jìn)行高水平表達(dá)所偏愛的密碼子，這種情況是可能的。利用偏愛密碼子（preferredcodons）并避免利用率低的或稀有的密碼子可以合成基因，基因的這種重新設(shè)計叫密碼子最佳化。在同源表達(dá)系統(tǒng)中，同較低水平表達(dá)的基因相比，較高表達(dá)的基因可能有很不同的密碼子偏愛。通過對密碼子利用的歸類分析，人們可以真正預(yù)測任何基因在酵母中的表達(dá)水平［2］。在諸如Zeamays的其他生物中，大量高表達(dá)基因強(qiáng)烈偏愛以G或C結(jié)尾的密碼子［3］。而且，在Dictyostelium中，同低水平表達(dá)的基因比較，高表達(dá)基因有較大數(shù)目的偏愛密碼子［4］。在大腸桿菌中表達(dá)哺乳動物基因是不可預(yù)測和具有挑戰(zhàn)的。例如直到最近才實現(xiàn)了人血紅蛋白的過表達(dá)［5］。為了達(dá)到血紅蛋白的好的表達(dá)水平，Alpha-球蛋白cDNA不得不用大腸桿菌偏愛的密碼子進(jìn)行重新合成。在異源宿主中實現(xiàn)象血紅蛋白這樣復(fù)雜的蛋白質(zhì)的過表達(dá)可能需要最佳化密碼子，這些研究者為此提供了令人信服的資料。成簇的低利用率的密碼子抑制了核糖體的運(yùn)動，這是基因不能以合適水平表達(dá)的一個明顯機(jī)制。核糖體翻譯由九個密碼子組成的信使（含幾個低利用率密碼子或全部為低利用率密碼子）時的運(yùn)動速度要比翻譯不含低利用率密碼子的同樣長的信使的速度慢。即使低利用率密碼子簇位于3'端，信使最后也會被核糖體”擁擠”而損害，核糖體又回到5'端。3'端低利用率密碼子簇的抑制效應(yīng)可以和全部信使都由低利用率密碼子組成的抑制效應(yīng)一樣大。如果低利用率密碼子簇位于5'端，其效應(yīng)是起始核糖體數(shù)目的全面減少，導(dǎo)致蛋白合成中信使的低效率。散在分布的稀有密碼子對翻譯的效應(yīng)還未很好地研究，但是有證據(jù)表明這種情況的確對翻譯效率有負(fù)面效應(yīng)［6］。其他因素也可以影響蛋白表達(dá)，包括使mRNA去穩(wěn)定的序列。重新設(shè)計合成基因可以去除或改變這些序列，導(dǎo)致高水平表達(dá)。消除稀有密碼子、去除任何去穩(wěn)定序列和利用最佳密碼子的基因的重新設(shè)計都可能增加蛋白產(chǎn)量，使的蛋白生產(chǎn)更有效和經(jīng)濟(jì)。翻譯終止效率蛋白表達(dá)水平受許多不同因素和過程影響。蛋白穩(wěn)定性、mRNA穩(wěn)定性和翻譯效率在蛋白生產(chǎn)和積累中起主要作用。翻譯過程分為起始、延伸和終止三個期。對于翻譯的起始，原核mRNA需要5'端非翻譯前導(dǎo)序列中有一段叫Shine-Dalgarno序列的特異核糖體結(jié)合序列。在真核細(xì)胞，有效的起始依賴于圍繞在起始密碼子ATG上下游的一段叫Kozak序列的序列。密碼子利用或偏愛對延伸有深刻的影響。例如，如果mRNA有很多成簇的稀有密碼子，這可能對核糖體的運(yùn)動速度造成負(fù)面影響，大大減低了蛋白表達(dá)水平。翻譯終止是蛋白生產(chǎn)必須的一步，但其對蛋白表達(dá)水平的影響還沒有被研究清楚。但是最近的科學(xué)研究表明終止對蛋白表達(dá)水平有很大的影響。總的來說，更有效的翻譯終止導(dǎo)致更好的蛋白表達(dá)。絕大多數(shù)生物都有偏愛的圍繞終止密碼子的序列框架［7］。酵母和哺乳動物偏愛的終止密碼子分別是UAA和UGA。單子葉植物最常利用UGA，而昆蟲和大腸桿菌傾向于用UAA。翻譯終止效率可能受緊接著終止密碼子的下游堿基和緊靠終止密碼子的上游序列影響。在酵母中通過改變圍繞終止密碼子的局部序列框架，翻譯終止效率可能被減低幾個100倍［8］。對于UGA和UAA,緊接著終止密碼子的下游堿基對有效終止的影響力大小次序為G>U，A>C；對于UAG是U、A〉C〉G。對于大腸桿菌，翻譯終止效率可因終止密碼子及臨近的下游堿基的不同而顯著不同，從80%（UAAU）到7%（UGAC）［9］。對于UAAN和UAGN系列，終止密碼子下游堿基對翻譯的有效終止的影響力大小次序為U〉G〉A(chǔ)、CoUAG極少被大腸桿菌利用，相比UAAN和UGAN，UAG表現(xiàn)了有效的終止，但其后的堿基對有效終止的影響力為G>U，A>C。對于哺乳動物，偏愛的終止密碼子為UGA，其后的堿基可以對invivo翻譯終止有8倍的影響（A、G〉〉C、U）。對于UAAN系列，invivo終止效率可以有70倍的差別，UGAN系列為8倍［10］。如果終止密碼子附近序列沒有最佳化，可能發(fā)生明顯增加的翻譯通讀，因此減少了蛋白表達(dá)。例如，在兔網(wǎng)狀細(xì)胞無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)里，UGAC的翻譯通讀可以高達(dá)10%，而第四個堿基如果為A，G或C,翻譯通讀為<1%［11］。總的來說，翻譯起始框架、翻譯終止序列框架和密碼子利用應(yīng)該仔細(xì)選擇，以利于蛋白的最高水平表達(dá)。翻譯終止序列框架能幾倍地改變蛋白生產(chǎn)水平。真核細(xì)胞中的異源蛋白表達(dá)異源蛋白質(zhì)在細(xì)菌中表達(dá)是目前使用的主要的蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)。大腸桿菌一直是最經(jīng)濟(jì)的系統(tǒng)之一。然而為了生產(chǎn)需要特異修飾、胞外分泌或有特異折疊需要的蛋白質(zhì)，其他表達(dá)系統(tǒng)也是需要的。真核細(xì)胞在表達(dá)原核來源的基因、真核基因的cDNA拷貝或其他無內(nèi)含子的基因時可能表現(xiàn)很多特異問題。富含AT的基因在很多真核細(xì)胞中表達(dá)時會遭遇很劇烈的障礙。主要的真核信號序列如加poly-A的位點(diǎn)、酵母轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)和真核mRNA去穩(wěn)定序列都是富含AT的。內(nèi)含子序列也趨向于富含AT,盡管他們有參與剪切過程的很特異的識別序列。雖然絕大多數(shù)原核基因沒有剪切或聚腺苷過程，但這些真核過程需要的保守序列可能存在于原核基因中，因此當(dāng)這些基因在真核細(xì)胞中表達(dá)時可能引起特異的問題。而且諸如哺乳動物和單子葉植物細(xì)胞的特異真核表達(dá)系統(tǒng)可能不能有效地表達(dá)無內(nèi)含子的基因。真核mRNA在離開細(xì)胞核進(jìn)而在胞漿的核糖體上被翻譯前需要特異的處理和修飾。這些過程包括去除內(nèi)含子、5'端甲基化帽子形成和3'端加poly-A。內(nèi)含子去除需要5'剪切位點(diǎn)、G75/G100U100A65AG65U保守序列、3'剪切位點(diǎn)、富含密啶NC66A100G100/G56保守序列和C72T98R77A100Y75保守序列［12］。有效的加poly-A和mRNA剪切需要一個由兩個部分組成的信號：加poly-A保守序列AAUAAA和在切割位點(diǎn)內(nèi)的50個堿基的富含GT的序列。酵母真核轉(zhuǎn)錄終止序列（幾個不同的富含AT序列，如含TTTTTATA［13］,TATATA，TACATA，TAGTAGTA［14］的一個38bp區(qū)域）被研究的最清楚。這些結(jié)果來自對酵母突變體CYCImRNA的mRNA水平和相對長度的確定的實驗。近期用invivo質(zhì)粒穩(wěn)定性分析的研究結(jié)果證明:TATATA似乎和原始的38bp野生型區(qū)域一樣有效地終止轉(zhuǎn)錄，而TAGATATATATGTAA和TACATA效率差些,TTTTTTTATA幾乎沒有效率［15］。所有這些序列在反方向時沒有終止轉(zhuǎn)錄功能。不幸的是幾乎沒有其他真核表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄終止序列方面的信息。內(nèi)含子對幾個哺乳動物基因的正常表達(dá)是必需的［12］，包括Beta-球蛋白、SV40latemRNA和二氫葉酸還原酶基因。單子葉植物細(xì)胞充分表達(dá)乙醇脫氫酶的cDNA拷貝［16］、報告基因氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、Beta葡萄糖苷酸酶和其他缺乏內(nèi)含子的基因［12］時也依賴內(nèi)含子。轉(zhuǎn)錄區(qū)域內(nèi)引入內(nèi)含子可以通過未確定的轉(zhuǎn)錄后機(jī)制增強(qiáng)表達(dá)。（免疫球蛋白基因）內(nèi)含子可能也包含轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，因此通過轉(zhuǎn)錄機(jī)制增強(qiáng)表達(dá)?？偟膩碇v，如果存在某些DNA序列，真核異源蛋白表達(dá)可能是個難題。為避免劇烈的表達(dá)減少，需要對基因進(jìn)行掃描，確認(rèn)是否含上述提及的富含AT的序列。而且，在幾個真核系統(tǒng)表達(dá)無內(nèi)含子基因可能需要引入內(nèi)含子以實現(xiàn)外源蛋白的充分表達(dá)。原核表達(dá)個人秘笈：表達(dá)前的分析比什么都重要生物通原核表達(dá)技術(shù)專輯：表達(dá)不同于其它一些實驗，比如：提取質(zhì)粒、PCR、電鏡切片，這些人為控制的因素比較多，出問題相對來說也比較好分析。表達(dá)呢，你把質(zhì)?？寺『美玻唤o細(xì)胞，然后有些事情就不全是你要怎樣就怎樣了。原核表達(dá)在表達(dá)當(dāng)中來說還是比較簡單，細(xì)菌培養(yǎng)條件簡單、生長速度快，需要的儀器和培養(yǎng)基都比較便宜。當(dāng)然，它也存在一些缺乏高級修飾、細(xì)胞內(nèi)部還原性過高等缺點(diǎn)。原核表達(dá)從一開始的設(shè)計就非常重要，所謂好的開始是成功的一半。做足準(zhǔn)備功夫，可是省去很多將來后悔的事情。首先，我們要根據(jù)是否要求可溶將載體分成兩大類，如果希望可以同時嘗試多種表達(dá)系統(tǒng)，也有許多商業(yè)化的系統(tǒng)供選擇。前面已經(jīng)介紹過許多公司的商業(yè)化載體、菌株和多系統(tǒng)表達(dá)體系，現(xiàn)在我想先從自己的蛋白分析講起。同樣的載體、同樣的系統(tǒng)，很可能表達(dá)這個蛋白表達(dá)量奇高，但是另外一個就是做不出來，所以沒有萬能的載體，只有永恒的分析。當(dāng)然如果你的蛋白曾經(jīng)在原核系統(tǒng)中成功表達(dá)出來那是最好的，選擇同樣的載體表達(dá)成功率會高很多。如果沒有也最好嘗試找一些曾經(jīng)表達(dá)過和你的蛋白擁有相類似結(jié)構(gòu)的文獻(xiàn)。比如大部分含有哺乳動物src同源的SH2蛋白相互作用域的蛋白都是用pGEX系列載體表達(dá)出來的。根據(jù)經(jīng)驗而言，含有較少半胱氨酸和脯氨酸的、平均大小為60kD的單體蛋白較容易表達(dá)。在下面將列出幾個影響表達(dá)的因素，大家可以在表達(dá)前根據(jù)這幾個因素自己分析一下：翻譯起始位點(diǎn)現(xiàn)在大部分的表達(dá)載體都提供起始位點(diǎn)，所以它已經(jīng)把起始密碼子與核糖體結(jié)合位點(diǎn)的距離進(jìn)行優(yōu)化了，一般情況下不需要自己再加，不過還是要留意載體圖譜上是否注明有起始密碼子和終止密碼子GC含量表達(dá)序列中的GC含量超過70%的時候可能會降低蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)水平。GC含量可以利用DNASTAR、VectorNTISuite等軟件進(jìn)行預(yù)測。二級結(jié)構(gòu)在起始密碼子附近的mRNA二級結(jié)構(gòu)可能會抑制翻譯的起始或者造成翻譯暫停從而產(chǎn)生不完全的蛋白。如果利用軟件分析DNA或RNA結(jié)構(gòu)上有柄（stem）結(jié)構(gòu)，并且結(jié)合長度超過8個堿基，這種結(jié)構(gòu)會因為位點(diǎn)專一突變等因素而變得不穩(wěn)定。基因或者蛋白的大小一般說來小于5kD或者大于100kD的蛋白都是難以表達(dá)的。蛋白越小，越容易被降解。在這種情況下可以采取串聯(lián)表達(dá)，在每個表達(dá)單位（即