豬氟烷陽性的研究

豬氟烷陽性的研究

自futii等人（1991年）確定了豬氟烷基因的磷酸序列和突變位點(diǎn)以來，pcr技術(shù)和不同的氟烷基因型的檢測(cè)方法日益先進(jìn)。90年代以前普遍使用的氟烷測(cè)定不能檢出雜合子,在育種場(chǎng)的使用趨于停止。國際上一些較大的種豬公司,如英國種豬改良公司(PIC,美國公司),其基因型檢測(cè)已完全取代了氟烷測(cè)驗(yàn)。氟烷基因是導(dǎo)致豬應(yīng)激綜合征(PigStressSyndromePSS)的主要遺傳學(xué)病因。隨著對(duì)PSS的深入研究,發(fā)現(xiàn)若干外界刺激因子包括屠宰前驅(qū)趕和混群等能夠影響不同基因型豬群PSE(Pale,Soft,Exudative)肉的發(fā)生率,但對(duì)基因型與氟烷反應(yīng)之間相互關(guān)系的研究迄今未見系統(tǒng)的報(bào)道,一般認(rèn)為氟烷陽性豬的基因型應(yīng)為隱性純合子(nn)。本研究對(duì)含1/2中國豬血統(tǒng)繼代選育豬群(SJ母系)進(jìn)行氟烷測(cè)驗(yàn)的同時(shí)對(duì)部分個(gè)體進(jìn)行了氟烷基因的PCR-RFLP分析,用基因檢測(cè)的方法,首次發(fā)現(xiàn)了基因型為雜合子(Nn)的氟烷反應(yīng)陽性豬。1材料和方法1.1氟烷陽性豬窩別、檢測(cè)和制備供試豬系江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種豬試驗(yàn)場(chǎng)培育的SJ母系三世代豬群,在體重15～20kg時(shí)每窩隨機(jī)抽取2公2母(計(jì)147頭)進(jìn)行氟烷測(cè)驗(yàn),對(duì)氟烷陽性豬的窩別于兩周后重復(fù)測(cè)驗(yàn),并采集陽性豬及其同胞的血液以制備基因組DNA。1.2煙氣流量測(cè)定采用歐洲常用方法,用日產(chǎn)獸用麻醉機(jī)和氟烷,測(cè)驗(yàn)步驟如下:起始氟烷濃度為4%,持續(xù)4min后改為1%1min;氧氣流量始終為2.5～3.0L/min,總測(cè)定時(shí)間為5min。供試豬在麻醉0～3min時(shí)保持側(cè)臥,3～4min時(shí)保持仰臥,4～5min時(shí)恢復(fù)至側(cè)臥狀態(tài),自45～60s時(shí)起開始輕輕抓住上側(cè)后肢蹄部屈伸,如果出現(xiàn)后肢屈伸低抗,胸腹部肌肉開始強(qiáng)直時(shí)將豬立即轉(zhuǎn)為仰臥,確認(rèn)反應(yīng)為陽性后中止麻醉。1.3dna分離和測(cè)定法采全血25mL,肝素抗凝,緩慢加入到等量國產(chǎn)淋巴細(xì)胞分離液中1500r/min,離心10min,吸取白細(xì)胞后采用ASAP基因組DN分離盒進(jìn)行RNA酶和蛋白酶消化并分離,將獲得的基因組DNA用雙蒸水定量稀釋成10ng/μL備用。1.4兩種溶液的混合按OtsuK的方法合成引物A和引物B,PCR反應(yīng)液的組成如下:基因組DNA10μL(100ng);dNTPs5μL(2mM);MgCl21μL(25mM);引物A1μL(11.8μΜ);引物B1μL(12.4μΜ);雙蒸水28μL。上述溶液混合后加入Tag酶2IU(4μL),反應(yīng)體積合計(jì)為50μL。反應(yīng)溫度:第1循環(huán)為94℃2min45s→65℃45s→72℃60s,第2循環(huán)為94℃45s→65℃45s→72℃60s,重復(fù)第2循環(huán)35次后置于4℃保存或電泳。1.5酶切產(chǎn)物的擴(kuò)增和電泳PCR產(chǎn)物15μL加入2μL(2.5ΙU)AspH1內(nèi)切酶37℃水浴1h。擴(kuò)增和酶切產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖100～120V電泳40min。然后經(jīng)Et-Br染色10min后觀察結(jié)果。2結(jié)果與分析2.1全同性生存率首次測(cè)驗(yàn)陽性豬3頭,陽性率為2.04%,其耳號(hào)分別為337、306和208,其中337和306為全同胞,且306在測(cè)驗(yàn)中途應(yīng)激搶救無效死亡。2.2基因組dna的獲得和pcr檢測(cè)采集337及其同胞331、208及其同胞206共4頭豬的全血各25mL,經(jīng)分離和酶解后分別獲得約500μL基因組DNA,其濃度均為1.0～1.5μg/μL,定量稀釋成10ng/μL后進(jìn)行PCR反應(yīng)。2.3鹽藻阿波多聚甲基苯磺酸鈉鹽和鹽析產(chǎn)物t-qp1色圖1PCR產(chǎn)物及4頭豬酶切片斷的電泳圖譜見示意圖1,自右向左分別為206號(hào)豬基因組DNA的PCR產(chǎn)物、337、331、208、206四頭豬酶切片斷及174(HaeⅢ)標(biāo)記片斷。根據(jù)理論推測(cè),AspH1將N基因的659片斷切成524和135兩段,而將n基因的659片斷切成358,166和135三段。所以雜合子(Nn)酶切產(chǎn)物應(yīng)具備524、358、166、135bp四條帶(圖中2、3泳道),隱性純合子(nn)應(yīng)具備358、166和135三條帶(圖中4、5泳道),顯性純合子(NN)應(yīng)具備524和135兩條帶(圖中沒有)?？梢?337和331為隱性純合子,208和206為雜合子。3基因型pcr檢測(cè)據(jù)SJ母系豬檢測(cè)結(jié)果,其中337和331為隱性純合子,氟烷反應(yīng)陽性,206號(hào)為雜合子,氟烷反應(yīng)陰性均與一般規(guī)律相符,但208號(hào)豬為雜合子,而氟烷反應(yīng)陽性,國內(nèi)外尚未見同類報(bào)道。在氟烷基因DNA檢測(cè)方法建立之前,大都采用測(cè)交與氟烷測(cè)驗(yàn)結(jié)合的辦法判斷基因型。Webb和Smith(1976)使用氟烷陽性的皮特蘭豬與氟烷陽性漢普夏豬交配,在75頭后代中測(cè)得96%個(gè)體為氟烷陽性,4%為陰性,即隱性純合子中出現(xiàn)有氟烷陰性個(gè)體。Mabry(1981)研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)氟烷基因具有不完全的外顯率。由于基因型PCR檢測(cè)方法建立較遲,故缺乏對(duì)氟烷陽性豬是否一定是隱性純合子的系統(tǒng)研究?；驒z測(cè)結(jié)果證實(shí)氟烷基因型對(duì)產(chǎn)生PSE肉的作用受到外界刺激因子的顯著影響。Christian等人(1980)對(duì)應(yīng)激反應(yīng)程度進(jìn)行評(píng)分,發(fā)現(xiàn)三種基因型(NN,Nn,nn)之間存在顯著的差異,但也有少數(shù)個(gè)體的評(píng)分結(jié)果與基因型不相符合,但沒有指明是否存在非隱性純合子出現(xiàn)氟烷反應(yīng)陽性的情況。綜上所述,迄今尚