第十一章 毒理學實驗方法

毒理學試驗方法試驗方法第一階段試驗

1第二階段試驗

2第三階段試驗

3第四階段試驗

4CompanyLogo第一階段試驗

1、急性吸入毒性試驗適用范圍：本方法規(guī)定了動物急性吸入毒性試驗的基本原則、技術和要求

本方法適用于評價氣體、揮發(fā)性物質或氣溶膠/顆粒物等化學品的急性吸入毒性作用。

CompanyLogo試驗目的：（1）檢測化學品對實驗動物的急性吸入毒性作用和強度。（2）為亞急(慢)性等吸入毒性試驗提供劑量選擇的依據(jù)。

CompanyLogo術語：急性吸入毒性(AcuteInhalationToxicity)：實驗動物短時間（24h內）持續(xù)吸入一種可吸入性受試樣品后，在短期內出現(xiàn)的健康損害效應。半數(shù)致死濃度（MedianLethalConcentration，LC50）：指在一定時間內經呼吸道吸入受試樣品后引起受試動物發(fā)生死亡的概率為50%的濃度。以單位體積空氣中受試樣品的質量(mg/m3)來表示。CompanyLogo試驗基本原則：各試驗組動物在一定時間內吸入不同濃度的受試樣品，染毒濃度的選擇可通過預試驗確定。染毒后觀察動物的毒性反應和死亡情況。試驗期間死亡的動物要進行尸檢，試驗結束時仍存活的動物要處死并進行大體解剖。CompanyLogo試驗方法實驗動物：首選健康成年小鼠(18g～22g)和大鼠(180g～220g)，也可選用其它敏感動物。同性別各劑量組個體間體重相差不得超過平均體重的20%。試驗前動物要在試驗環(huán)境中至少適應3～5d時間。CompanyLogo劑量設計：根據(jù)所選方法的要求，原則上應設4～5個劑量組，每組動物一般為10只，雌雄各半。各劑量組間距大小以兼顧產生毒性大小和死亡為宜，通常以較大組距和較少量動物進行預試。如果受試樣品毒性很低，也可采用一次限量法，即用20只動物（雌雄各半），10000mg/m3吸入2h或5000mg/m3吸入4h，如未引起動物死亡，則不再進行多個劑量的急性吸入毒性試驗。CompanyLogo染毒方法：（1）靜式染毒法（2）動式染毒法CompanyLogo靜式染毒法靜式染毒是將實驗動物放在一定體積的密閉容器（染毒柜）內，加入一定量的受試樣品，并使其揮發(fā)，造成試驗需要的受試樣品濃度的空氣，一次吸入性染毒2h。（1）染毒柜的容積以每只染毒小鼠每小時不少于3L空氣計，每只大鼠每小時不少于30L計。（2）染毒濃度的計算：染毒濃度一般應采用實際測定濃度。在染毒期間一般可測4～5次，求其平均濃度。在無適當測試方法時。計算染毒濃度：C=(a×d/v)×106式中：C--染毒濃度(mg/m3)；a--加入受試樣品的量(ml)d--化學品密度；v--染毒柜容積(L)CompanyLogo動式染毒法動式染毒是采用機械通風裝置，連續(xù)不斷地將含有一定濃度受試樣品的空氣均勻不斷地送入染毒柜，空氣交換量大約為12～15次/h，并排出等量的染毒氣體，維持相對穩(wěn)定的染毒濃度（對通過染毒柜的流動氣體應不間斷地進行監(jiān)測，并至少記錄2次）。一次吸入性染毒2h。當受試化合物需要特殊要求時，應用其它的氣流速率。染毒時，染毒柜內應確保至少有19%的氧含量和均衡分配的染毒氣體。一般情況下，為確保染毒柜內空氣穩(wěn)定，實驗動物的體積不應超過染毒柜體積的5%。且染毒柜內應維持微弱的負壓，以防受試樣品泄露污染周圍環(huán)境。同時，應注意防止受試樣品爆炸。CompanyLogo觀察期限及指標：（1）觀察并記錄染毒過程和觀察期內的動物中毒和死亡情況。觀察期限一般為14d，觀察指標，計算LC50。（2）對死亡動物進行尸檢。觀察期結束后，處死存活動物并進行大體解剖，如有必要，進行病理組織學檢查。

CompanyLogo試驗結果評價評價試驗結果時，應將LC50與觀察到的毒性效應和尸檢所見相結合考慮，LC50值是受試樣品急性毒性分級和標簽標識以及判定受試樣品經呼吸道吸入后引起動物死亡可能性大小的依據(jù)。引用LC50值時一定要注明所用實驗動物的種屬、性別、染毒方式及時間長短、觀察期限等。評價應包括動物接觸受試樣品與動物異常表現(xiàn)（包括行為和癥狀改變、大體損傷、體重變化、致死效應及其它毒性作用）的發(fā)生率和嚴重程度之間的關系。

CompanyLogo鑒定報告內容（1）受試樣品名稱、理化性狀、配制方法、所用濃度；（2）動式染毒設備中的氣流速度；（3）實驗動物的種屬、品系和來源（注明合格證號和動物級別）；（4）實驗動物飼養(yǎng)環(huán)境，包括飼料來源、室溫、相對濕度、動物實驗室合格證號；（5）所用染毒濃度和動物分組，每組所用動物性別、數(shù)量及體重范圍；（6）計算LC50的方法；（7）染毒后動物中毒表現(xiàn)及出現(xiàn)時間和恢復情況、死亡時間、大體解剖所見；（8）列表報告結果（建議的表格形式見附錄1-D），計算的LC50及其95%可信區(qū)間；（9）結論。CompanyLogo2、急性經皮毒性試驗適用范圍：本方法規(guī)定了動物急性經皮毒性試驗的基本原則、技術和要求。本方法適用于評價化學品的急性經皮毒性。CompanyLogo試驗目的：

確定受試樣品能否經皮膚吸收和短期經皮染毒所產生的毒性作用和強度，并為確定亞急（慢）性經皮毒性及其它試驗的劑量設計提供試驗依據(jù)。CompanyLogo術語：急性經皮毒性(AcuteDermalToxicity)：受試樣品一次或在24h內多次經皮膚染毒所產生的健康損害效應。經皮半數(shù)致死劑量（DermalMedianLethalDose）：一次或在24h內多次經皮膚染毒受試樣品引起50%實驗動物死亡的劑量，以mg/kgbw表示。CompanyLogo試驗基本原則：在試驗前，先去除實驗動物受試部位的被毛。將實驗動物分成若干劑量組，每組涂布不同劑量的受試樣品，而后觀察實驗動物中毒反應和死亡情況，計算LD50。對試驗中死亡的動物做大體解剖和病理學檢查，對試驗結束時的存活動物也應做大體解剖。注意排除受試樣品引起的皮膚局部刺激或腐蝕作用所致的全身效應。CompanyLogo試驗方法（1）受試樣品配制：固體受試樣品應研磨，過100目篩。用適量無毒無刺激性賦形劑混勻，以保證受試樣品與皮膚良好的接觸。常用的賦形劑有水、植物油、凡士林、羊毛脂等。液體受試樣品一般不必稀釋，可直接用原液試驗。CompanyLogo（2）實驗動物

首選大鼠，也可選用豚鼠或家兔。實驗動物體重要求范圍分別為：大鼠200～300g，豚鼠350～450g，家兔2000～3000g。試驗期間，為避免實驗動物相互抓撓，應采用單籠喂養(yǎng)。試驗前24h，在動物背部正中線兩側剪毛或剃毛，仔細檢查皮膚，要求完整無損，以免改變皮膚的通透性。去毛面積不應少于實驗動物體表面積的10%。CompanyLogo（3）劑量和分組實驗動物隨機分為4～5個劑量組。若使用水、植物油、凡士林、羊毛脂外的賦形劑，則需設賦形劑對照組。豚鼠或大鼠每一劑量組（單性別）不少于5只；家兔每一劑量組（單性別）不少于4只。各劑量組間要有適當?shù)慕M距，可按等比或等差級設置劑量，以使各劑量組實驗動物產生的毒性反應和死亡率呈現(xiàn)劑量-反應（效應）關系。一般情況下，如果劑量達到2000mg/kgbw仍不出現(xiàn)實驗動物死亡時，則不需要再進行高劑量試驗。CompanyLogo（4）試驗步驟選擇適當方法固定好實驗動物，將受試樣品均勻涂布于實驗動物的去毛區(qū)，并用油紙和兩層紗布覆蓋，再用無刺激性膠布或繃帶加以固定，以保證受試樣品和皮膚的密切接觸，防止脫落和動物舔食受試樣品。涂布4h后取下固定物和覆蓋物，用溫水或適當?shù)娜軇┫慈テつw上殘留的受試樣品。CompanyLogo（5）觀察期限及指標觀察并記錄染毒過程和觀察期內的動物的中毒和死亡情況。觀察期限一般為14d，全面觀察中毒的發(fā)生、發(fā)展過程和規(guī)律以及中毒特點和毒作用的靶器官，觀察指標，計算LD50。對死亡動物進行尸檢。觀察期結束后，處死存活動物并進行大體解剖，如有必要，進行病理組織學檢查。CompanyLogo鑒定報告內容（1）實驗動物種屬品系、來源、飼養(yǎng)環(huán)境、飼料和飲水；（2）按劑量組列表說明每組動物數(shù)、性別狀況、出現(xiàn)毒效應的動物數(shù)、死亡動物數(shù)；（3）染毒時間、染毒持續(xù)時間、染毒后動物中毒的主要表現(xiàn)；（4）LD50計算方法；（5）LD50值及其95%可信區(qū)間（包括雌、雄實驗動物各自的LD50）；（6）病理組織學檢查結果；（6）結論。CompanyLogo試驗結果的解釋經皮LD50是評價化學物急性毒性的重要參數(shù)之一，也是急性毒性分級的依據(jù)。但LD50僅表示受試樣品經皮吸收引起實驗動物死亡50%的劑量，并不能全面反映受試樣品經皮吸收的所有急性毒性特征，因此，評價一受試樣品經皮急性毒性既要考慮其對某一品系實驗動物的經皮LD50值，又要考慮其中毒癥狀表現(xiàn)及反應出現(xiàn)的早晚和持續(xù)時間的長短，并結合體重變化與病理學檢查結果等，經綜合分析才能得出經皮急性毒性較為全面的評價。CompanyLogo3、急性經口毒性試驗適用范圍：本方法規(guī)定了動物急性經口毒性試驗的基本原則、技術和要求。本方法適用于評價化學品的急性毒性作用。

CompanyLogo試驗目的：（1）檢測化學品對實驗動物的急性毒性作用和強度。（2）為亞急(慢)性等毒性試驗提供劑量選擇的依據(jù)。（3）試驗結果可作為化學品急性毒性分級和標簽標識。CompanyLogo術語：急性經口毒性(AcuteOralToxicity):一次或在24h內多次經口給予實驗動物受試樣品后，動物在短期內出現(xiàn)的健康損害效應。經口半數(shù)致死劑量（OralMedianLethalDose）：經口一次或24h內多次經口給予受試樣品后，引起實驗動物總體中半數(shù)死亡的毒物的統(tǒng)計學劑量。以單位體重接受受試樣品的質量(mg/kgbw或g/kgbw)來表示。CompanyLogo試驗基本原則：以經口灌胃法給予各試驗組動物不同劑量的受試樣品，每組用一個劑量，染毒劑量的選擇可通過預試驗確定。染毒后觀察動物的毒性反應和死亡情況。試驗期間死亡的動物要進行尸檢，試驗結束時仍存活的動物要處死并進行大體解剖。本方法主要適用于嚙齒類動物的研究，但也可用于非嚙齒類動物的研究。CompanyLogo試驗方法（1）受試樣品的處理受試樣品應溶解或懸浮于適宜的賦形劑中，（不溶性固體或顆粒狀物質研磨、過100目篩）建議首選水或食用植物油（如玉米油）作溶劑，也可考慮使用其它賦形劑（如羧甲基纖維素、明膠、淀粉等）等配成混懸液；不能配制成混懸液時，可配制成其它形式(如糊狀物等)，但不能采用具有明顯毒性的有機化學溶劑。如采用有毒性的溶劑應單設溶劑對照組觀察。CompanyLogo(2)實驗動物首選健康成年小鼠(18g～22g)和大鼠(180g～220g)，也可選用其它敏感動物。同性別實驗動物個體間體重相差不得超過平均體重的20%。試驗前動物要在試驗環(huán)境中至少適應3～5d時間。

CompanyLogo（3）劑量設計根據(jù)所選方法的要求，原則上應設4～5個劑量組，每組動物一般為10只，雌雄各半。各劑量組間距大小以兼顧產生毒性大小和死亡為宜，通常以較大組距和較少量動物進行預試。如果受試樣品毒性很低，也可采用最大限量法，即用20只動物（雌雄各半），采用5000mg/kgbw劑量，如未引起動物死亡，可不再進行多個劑量的急性經口毒性試驗。CompanyLogo（4）試驗步驟試驗前實驗動物應禁食（一般16h左右），不限制飲水。若采用代謝率高的其它動物，禁食時間可以適當縮短。正式試驗時，稱量動物體重，隨機分組，然后對各組動物用經口灌胃法一次染毒。各劑量組的灌胃體積應相同,小鼠常用容量為20ml/kgbw，大鼠常用容量為10ml/kgbw。若一次給予容量太大，也可在24ｈ內分2～3次染毒（每次間隔4h～6h），但合并作為一次劑量計算。染毒后繼續(xù)禁食3h～4h。若采用分批多次染毒，根據(jù)染毒間隔長短，必要時可給動物一定量的食物和水。CompanyLogo（5）觀察期限及指標觀察并記錄染毒過程和觀察期內的動物的中毒和死亡情況。觀察期限一般為14d，觀察指標、LD50的計算。對死亡動物進行尸檢。觀察期結束后，處死存活動物并進行大體解剖，如有必要，進行病理組織學檢查。CompanyLogo鑒定報告內容（1）受試樣品名稱、理化性狀、配制方法、所用濃度；（2）實驗動物的種屬、品系和來源（注明合格證號和動物級別）；（3）實驗動物飼養(yǎng)環(huán)境，包括飼料來源、室溫、相對濕度、動物實驗室合格證號；（4）所用劑量和動物分組，每組所用動物性別、數(shù)量及體重范圍；（5）染毒后動物中毒表現(xiàn)和死亡情況及出現(xiàn)時間，大體解剖及病理所見；（6）計算LD50的方法及其LD50和95%可信限；（7）列表報告結果；（8）結論。CompanyLogo4、急性眼刺激性/腐蝕性試驗適用范圍：本規(guī)范規(guī)定了動物急性眼刺激/腐蝕性試驗的基本原則、要求和方法本規(guī)范適用于檢測化學物的眼睛刺激性/腐蝕性。CompanyLogo試驗目的：確定評價化學物對哺乳動物眼睛是否有刺激作用/腐蝕作用及其程度。CompanyLogo術語：眼睛刺激性(EyeIrritation)：指眼球表面接觸受試樣品后產生的可逆性炎性變化。4.2眼睛腐蝕性(EyeCorrosion)：指眼球表面接觸受試樣品后引起的不可逆性組織損傷。CompanyLogo試驗基本原則（1）受試樣品以一次劑量滴入每只實驗動物的一側眼睛結膜囊內，以未作處理的另一側眼睛作為自身對照；（2）在規(guī)定的時間間隔內，觀察對動物眼睛的刺激和腐蝕作用程度并評分，以此評價受試樣品對眼睛的刺激作用。觀察時間應能足以評價刺激效應的可逆性和不可逆性。觀察時間最少72h，但一般不超過21d；（3）當動物出現(xiàn)嚴重和持久的痛苦跡象時，以適當?shù)姆绞綄游锾幩?；?）強酸或強堿物質如pH≤2或pH≥11.5，由于其可預見的腐蝕特性，不必做本試驗；（5）已在皮膚試驗中證實具有腐蝕或嚴重刺激毒性的物質不必進行眼刺激試驗，可以推測該物質對眼睛將會引起相似的嚴重結果；（6）在充分并公認的體外試驗結果中確定可能產生刺激性或腐蝕性的物質不必進行體內試驗。CompanyLogo試驗方法

（1）受試樣品：液體、固體或半固體、顆粒物。（2）實驗動物和飼養(yǎng)環(huán)境飼養(yǎng)環(huán)境：動物實驗室應符合國家相應規(guī)定。常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

CompanyLogo動物種屬首選健康成年白色家兔，體重2～3kg。如果使用其它的哺乳動物做試驗，試驗者應提供選擇的依據(jù)。動物數(shù)量如果受試樣品的顯著效應是可預見的，可以考慮用一只動物。如果用一只動物試驗得出的結果提示受試樣品有嚴重的刺激性和腐蝕性，則不必進行進一步的試驗。如果結果相反，則至少需要3只家兔。有時，在增加動物的進一步試驗中應該適當?shù)年U明可疑反應。CompanyLogo（3）劑量設計對于液態(tài)受試樣品，一般不需稀釋，可直接使用原液，染毒量為0.1ml。若受試樣品為固態(tài)或顆粒狀，應將其研磨成細粉狀，過200目篩，染毒量應為100mg。氣溶膠產品需噴至容器中，收集其液體再使用。對揮發(fā)性物質，劑量可以通過使用前后稱量容器質量進行估計。CompanyLogo（4）試驗步驟①試驗前眼睛的檢查試驗前動物要在動物實驗室環(huán)境中至少適應3d時間。試驗前24h，要對實驗動物的兩只眼睛進行常規(guī)檢查。有眼睛刺激癥狀、角膜缺陷或結膜損傷的動物不能用于試驗。CompanyLogo②染毒輕輕拉開實驗動物一側眼睛的下眼瞼，將受試樣品0.1ml(100mg)滴入(或放入)結膜囊中，使上、下眼簾被動閉合1s，以防止受試樣品丟失。未處理的另一側眼睛作為自身對照。滴入受試樣品24h內不沖洗眼睛，如果認為必要，在24h時可進行沖洗。如果受試樣品有明顯的刺激征象，另選3只動物進行沖洗試驗。在滴入受試樣品30s后，用生理鹽水沖洗5min，水的流量和流速都不應導致眼損傷。CompanyLogo③觀察周期觀察時間最少要72h，也不能嚴格固定不變，但必須足夠以充分評估觀察到的可逆或不可逆效應。通常觀察時間一般不超過21d。CompanyLogo④檢查和評分在滴入受試樣品后的第1h，24h，48h，72h和96h對眼睛進行檢查，如果72h時未出現(xiàn)刺激反應，可終止試驗。如果發(fā)現(xiàn)累及角膜或有其它眼刺激作用，7d內不恢復者，為確定該損害的可逆性或不可逆性需延長觀察時間，一般不超過21d。除了對角膜、虹膜、結膜進行觀察外，其它損害效應都應記錄并報告。在24h觀察和記錄結束后，可使用熒光素鈉對所有動物的眼睛作進一步檢查。在每次檢查中均應按表1記錄眼的刺激反應，并按表2進行眼刺激強度評價。CompanyLogo⑤結果統(tǒng)計與評價數(shù)據(jù)應以表格形式匯總，記錄觀察期內每只動物的刺激評分，直到癥狀消失或21d試驗結束。詳細描述刺激的程度和性質，嚴重損害的出現(xiàn)，以及觀察到的除眼以外的任何效應。按表4進行統(tǒng)計。眼刺激評分應與觀察到的反應的性質和可逆性或其它方面結合進行評價。單獨的積分值不能作為受試樣品的刺激性質的最后評判，應將所有觀察結果及各種因素進行綜合評價。CompanyLogo鑒定報告內容（1）表格記錄每只動物每個時間點（如1h,24h,48h，72h和4d,7d）的刺激反應；（2）具體描述除眼部以外的其它作用；（3）刺激／腐蝕程度和性質的描述；（4）描述在各觀察時點積分時的檢查方法（如裂隙燈、生物顯微鏡、熒光素染色）；（5）結論。CompanyLogo4、皮膚刺激性/腐蝕性試驗適用范圍：本規(guī)范規(guī)定了動物皮膚刺激/腐蝕性試驗的基本原則、要求和方法。本規(guī)范適用于檢測化學品對皮膚的刺激性/腐蝕性。CompanyLogo試驗目的：確定化學物對哺乳動物皮膚局部是否有刺激作用或腐蝕作用及其程度，為制定防護化學物對皮膚的刺激保護措施提供依據(jù)。CompanyLogo術語：皮膚刺激性(DermalIrritation)：皮膚涂敷受試樣品后局部產生的可逆性炎性變化。皮膚腐蝕性(DermalCorrosion)：皮膚涂敷受試樣品后局部引起的不可逆組織損傷。CompanyLogo試驗基本原則（1）將受試樣品一次（或多次）涂（敷）于健康無破損的皮膚上，并作自身對照（除非懷疑有嚴重的刺激/腐蝕并逐漸發(fā)展）；（2）在規(guī)定時間間隔內觀察和評價刺激反應的程度，并作詳細的記錄。觀察時間應足夠進行可逆或不可逆效應的觀察，以便進行完整的評價，但一般不超過14天；（3）強酸或強堿物質如pH≤2或pH≥11.5，由于可預見其腐蝕特性，不必做本試驗；（4）若已知受試樣品有很強的經皮吸收毒性（LD50≤200mg/kgbw）的物質不必進行本試驗；（5）在充分并公認的體外試驗結果中確定可能產生腐蝕或刺激毒性的物質不必進行體內試驗。如果從受試樣品的結構活性構效關系可以預見潛在的腐蝕毒性，則不必做本試驗。CompanyLogo試驗方法

（1）受試樣品液態(tài)受試樣品采用原液或人類實際應用濃度。固體受試樣品經研磨粉碎，過100目篩，然后用水或適當?shù)馁x形劑（如凡士林、阿拉伯樹膠、乙醇和水、羧甲基纖維素、聚乙二醇、丙三醇、植物油和礦物油等）按一定比例調制，以保證與皮膚充分接觸。當使用賦形劑時，要考慮賦形劑對受試樣品皮膚刺激效應的影響，使用的賦形劑既不能改變受試樣品的吸收、分布、代謝、蓄積或化學性質，也不能增強、減弱或改變它的毒性特征。CompanyLogo（2）實驗動物和飼養(yǎng)環(huán)境首選健康成年白色家兔，其次為白色豚鼠。如果使用其他的哺乳動物做試驗，試驗者應提供選擇的依據(jù)。至少需要4只健康成年動物（雄性和/或雌性均可），除非提供選擇較少動物的依據(jù)。推薦使用逐步接觸法，以便闡明可疑反應。每只動物相鄰的未處理的皮膚可作為對照。實驗動物應單籠飼養(yǎng)，試驗前動物要在動物實驗室中至少適應3d時間。實驗動物和動物實驗室應符合國家相應規(guī)定。常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。CompanyLogo劑量設計受試樣品0.5m1(g)，均勻涂布于受試部位。如受試樣品難以獲得，或易產生全身毒性等原因，用量可適當減少。但為了試驗的一致性，測試面積應力求相等。CompanyLogo試驗步驟（1）試驗前準備試驗前24h，將實驗動物脊柱兩側毛剪去或剃掉，不可損傷表皮，去毛范圍左右各3cm×3cm。24h后，選擇皮膚健康完整無損的動物進行試驗。不應在長有濃密島狀毛的部位進行受試樣品試驗。（2）染毒取受試樣品0.5ml(g)直接涂布在皮膚上，用二層紗布（2.5cm×2.5cm）和一層玻璃紙或類似物覆蓋，再用無刺激性膠布和繃帶加以固定。另一側皮膚作為對照。采用封閉試驗，敷用時間為4h。試驗結束后，用溫水或無刺激性溶劑清除殘留受試樣品。如懷疑受試樣品可能引起嚴重刺激或腐蝕作用，可采用分段試驗，將三個涂布受試樣品的紗布塊同時或先后敷貼于一只家兔背部脫毛區(qū)皮膚上，分別于涂敷后3min、60min和4h取下一塊紗布，皮膚涂敷部位在任一時間點出現(xiàn)腐蝕作用，即可停止試驗。CompanyLogo（3）觀察期限觀察時間的確定應足以觀察到可逆和不可逆刺激作用的全過程，一般不超過14d。于清除受試樣品后的1、24、48、72h分別觀察給予受試樣品部位的皮膚反應，按表1進行皮膚反應評分，以受試動物積分的平均值進行綜合評價，根據(jù)24、48和72h各觀察時點最高積分均值，判定皮膚刺激強度。CompanyLogo（4）結果統(tǒng)計與評價：數(shù)據(jù)匯總。皮膚刺激評分應與觀察到的反應的性質和可逆性或其它方面綜合進行評價。單獨的積分值不能作為受試樣品的刺激性質的最后評判，可以作為參考值，在完整的觀察描述和評價下具有一定意義。除根據(jù)皮膚紅斑、水腫形成的標準積分外，還應結合刺激作用的性質、恢復程度等進行化學物刺激作用的綜合評價。

CompanyLogo鑒定報告內容（1）用表格記錄每只動物每個時間點（如第1、24、48和72小時，直到損害逆轉或試驗終止）的紅斑、水腫以及其它皮膚損害/反應；（2）觀察到的任何損傷和系統(tǒng)效應；（3）刺激／腐蝕程度和性質的描述；（4）結論。CompanyLogo試驗結果的解釋

急性皮膚刺激試驗結果從動物外推到人的可靠性很有限。白色家兔在大多數(shù)情況下對有刺激性或腐蝕性的物質較人類敏感。若用其它品系動物進行試驗時也得到類似結果，則會增加從動物外推到人的可靠性。試驗中使用封閉式接觸是一種超常的實驗室條件下的試驗，在人類實際接觸化學品過程中很少存在這種接觸方式。CompanyLogo5、皮膚變態(tài)反應實驗（皮膚致敏試驗）適用范圍：本規(guī)范規(guī)定了動物皮膚致敏試驗的基本原則、要求和方法。本規(guī)范適用于檢測化學品對皮膚的變態(tài)反應性。CompanyLogo試驗目的：確定重復接觸化學物對哺乳動物是否可引起皮膚變態(tài)反應及其程度。CompanyLogo術語皮膚致敏反應/過敏性接觸性皮炎（SkinSensitization/AllergicContactDermatitis)：是皮膚對一種物質產生的免疫源性皮膚反應。對于人類這種反應可能以搔癢、紅斑、丘疹、水皰、融合水皰為特征。動物的反應不同，可能只見到皮膚紅斑和水腫。誘導接觸(InductionExposure)：指機體通過接觸受試樣品以達到誘導產生致敏狀態(tài)目的的試驗性暴露；誘導期(InductionPeriod)：指機體通過接觸受試樣品而誘導出過敏狀態(tài)所需的時間；激發(fā)接觸(ChallengeExposure)：機體接受誘導暴露后，再次接觸受試樣品的試驗性暴露，以確定皮膚是否會出現(xiàn)過敏反應。CompanyLogo試驗基本原則：實驗動物通過多次皮膚涂抹誘導接觸受試樣品10～14d（誘導期）后，給予激發(fā)劑量的受試樣品，觀察實驗動物，并與對照動物比較對激發(fā)接觸受試樣品的皮膚反應強度。CompanyLogo試驗方法動物種屬首選健康、成年的白色豚鼠，體重250～300g。如選擇其它種屬，試驗者需提供選擇的依據(jù)。動物實驗室和飼養(yǎng)動物實驗室應符合國家相應規(guī)定。動物自由飲食和飲水。需提供富含維生素C的食物。動物數(shù)量和性別動物數(shù)量和性別依賴于選擇的試驗方法。兩種性別均可用于局部封閉敷貼法（Buehlertest）和豚鼠最大反應試驗（GPMT）。雌性動物應該是未生育過和未懷孕的。Buehler試驗要求試驗組至少20只豚鼠，對照組至少10只。GPMT要求試驗組至少10只豚鼠，對照組至少5只，如果試驗結果難以確定受試樣品的致敏性，應增加動物數(shù)，試驗組至少20只，對照組至少10只。CompanyLogo試驗方法可靠性的檢查使用已知的能引起輕度/中度致敏的陽性物每隔6個月檢查一次。局部封閉涂皮法至少有30%動物出現(xiàn)皮膚過敏反應；皮內注射法至少有60%動物出現(xiàn)皮膚過敏反應。陽性物一般采用：

已苯乙烯醛(CASNo.101–86–0)；

巰基苯并噻唑(CASNo.149–30–4)；

氨基苯甲酸乙酯(CASNo.94–09–7)；

二硝基氯苯(CASNo.97–00–7)；或

DER331環(huán)氧樹脂。CompanyLogo劑量設計試驗劑量水平可以通過少量動物(2～3只)的預試驗獲得。誘導劑量為能引起皮膚刺激反應的最高濃度，激發(fā)劑量為不能引起皮膚刺激作用的最高劑量。水溶性受試樣品可用水或無刺激性表面活性劑作為賦形劑，其它受試樣品可用80%乙醇(誘導接觸)或丙酮(激發(fā)接觸)作賦形劑。CompanyLogo試驗步驟局部封閉涂皮法（Buehlertest）（1）動物數(shù)：試驗組至少20只，對照組至少10只。（2）劑量水平：用2～3只動物進行預試驗，尋找能引起皮膚輕度刺激反應的最高濃度（劑量）。在試驗中設陰性對照組，在誘導接觸時該組僅涂以溶劑作為對照；在激發(fā)接觸時該組涂以受試樣品。對照組動物必須與受試樣品組動物為同一批。在實驗室開展致敏反應試驗初期、或使用新的動物種屬或品系時，需同時設陽性對照組。CompanyLogo（3）誘導接觸：試驗前24h實驗動物背部左側去毛，去毛范圍為4cm2～6cm2。于第0、7、14d分別將0.4ml新配制的受試樣品（最小刺激濃度）涂布在背部左側2cm×2cm的區(qū)域，以二層紗布和一層玻璃紙覆蓋，再以無刺激膠帶封閉固定6h后，移去敷貼物，清除殘留受試樣品。（4）激發(fā)接觸：末次誘導2W后，即第28d，將0.4ml受試樣品（最大無刺激濃度,建議為誘導濃度的1/2）敷貼于豚鼠右側背部2cm×2cm的脫毛區(qū)(試驗前24h去毛)，然后用二層紗布和一層玻璃紙覆蓋，后者緊貼皮膚，再以無刺激膠帶封閉固定6h后，移去敷貼物，清洗方法同前。CompanyLogo（5）結果觀察與評價：在24、48h后分別觀察局部皮膚反應。用盲法觀察對照組和試驗組。按表1對局部皮膚反應評分。當受試樣品組動物出現(xiàn)皮膚反應積分≥2時，判為該動物出現(xiàn)皮膚致敏反應陽性，并計算致敏率，按表2判定受試樣品的致敏強度。如果結果可疑，該動物可以一周后重新激發(fā)，用最初的對照組或新的對照組進行比較。CompanyLogo鑒定報告內容（1）陽性試驗信息，包括陽性對照物、試驗方法和試驗時間；（2）評分等級系統(tǒng)的簡要描述；（3）誘導和激發(fā)使用的賦形劑，如果不是水和生理鹽水，說明使用的理由。任何可能與受試樣品反應、或增強、或妨礙吸收的原料均應報告；（4）誘導和激發(fā)使用受試樣品的總量，每次使用的技術；（5）結論CompanyLogo第二階段試驗1、鼠傷寒沙門氏桿菌回復突變試驗（Ames試驗）適用范圍：本規(guī)范規(guī)定了鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗（Ames試驗）的基本原則、要求和方法。本規(guī)范適用于檢測化學品（有殺菌作用的除外）的致突變性。CompanyLogo試驗目的：檢測化學物質的誘變性，預測其遺傳危害和潛在致癌作用的可能性。

CompanyLogo術語：回復突變（ReverseMutation）：細菌在化學突變物作用下由營養(yǎng)缺陷型回變到野生型。鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗(SalmonellaTyphimuriumReverseMutationAssay)：利用一組鼠傷寒沙門氏組氨酸缺陷型試驗菌株測定引起沙門氏菌堿基置換或移碼突變的化學物質所誘發(fā)的組氨酸缺陷型（his-）回變到野生型（his+）的試驗方法。CompanyLogo試驗基本原理鼠傷寒沙門氏組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株不能合成組氨酸，故在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上，僅少數(shù)自發(fā)回復突變的細菌生長。假如有致突變物存在，則營養(yǎng)缺陷型的細菌回復突變成野生型，因此能生長形成菌落，據(jù)此判斷受試樣品是否為致突變物。某些致突變物需要代謝活化后才能引起回復突變，故需加入經誘導劑誘導的大鼠肝制備的S9混合液。CompanyLogo試驗方法（1）樣品處理選定受試樣品的合適溶劑,首選無菌雙蒸水作為溶劑，如果不溶于水的或水溶性低的化學物，首選二甲基亞砜。（2）劑量設計決定受試樣品最高劑量的標準是對細菌的毒性及其溶解度。自發(fā)回變數(shù)的減少，背景變得清晰或被處理的培養(yǎng)物細菌存活數(shù)減少，都是毒性的標志。每一受試樣品檢測時至少設五個劑量組，可按5～5000μg/皿劑量設定，也可根據(jù)預試驗結果按等比組距設定需要的濃度范圍。CompanyLogo試驗方法（1）配制培養(yǎng)基和試劑（2）20%葡萄糖溶液：稱取200g葡萄糖，加入蒸鎦水至1000ml，0.068MPa高壓滅菌20min。貯于4℃冰箱。（3）0.5mmol/L組氨酸－0.5mmol/L生物素溶液成分：D-生物素（分子量244）122mgL-組氨酸(分子量155)78mg無菌蒸餾水至1000ml不宜進行高壓滅菌處理，使用無菌玻璃器皿配制。貯于4℃冰箱。（4）代謝活化系統(tǒng)：肝混合功能氧化酶混合液(S9混合液)，配制方法見附錄2-ACompanyLogo（5）鹽溶液（1.65mol/LKCl+0.4mol/LMgCl2）氯化鉀(KCl)61.5g氯化鎂(MgCl2˙6H2O)40.7g蒸餾水至500ml0.103MPa高壓滅菌30min。貯于4℃冰箱。（6）0.2mol/L磷酸鹽緩沖液（PH7.4）磷酸二氫鈉（NaH2PO4.2H2O）2.965g磷酸氫二鈉（Na2HPO4.12H2O）29.015g蒸鎦水至500ml0.103MPa高壓滅菌30min。貯于4℃冰箱。（7）0.15mol/L氯化鉀溶液：精確稱取氯化鉀11.18g，用蒸餾水稀釋至1000ml，0.103MPa高壓滅菌30min。貯于4℃冰箱。CompanyLogo（8）氨芐青霉素堿性溶液（8mg/ml）稱取氨芐青霉素80mg，加入0.02mol/LNaOH溶液10ml。（9）0.1%結晶紫溶液稱取結晶紫10mg，加10ml無菌水。（10）四環(huán)素溶液（8mg/ml）稱取四環(huán)素40mg，加入0.02mol/LHCl溶液5ml。（11）溶解或稀釋化學物質常用溶劑：蒸餾水、二甲基亞楓(DMSO)（1）常用陽性對照及參考劑量：柔毛霉素60μg/ml疊氮化鈉（NaN3）50μg/ml2-氨基芴（2-FA）1000μg/ml敵克松（dexon）1000μg/ml絲裂霉素C（mytomycinC，MMC）

10ug/mlCompanyLogo菌株

一般使用鼠傷寒沙門氏桿菌TA97a或TA97、TA98、TA100、TA102菌株，特殊情況下選用TA1535、TA1537等菌株。菌株鑒定新獲得的或長期保存的菌種，在試驗前必須進行菌株的生物特性鑒定CompanyLogo試驗方法平板摻入法（1）倒平板:先將底層培養(yǎng)基在45℃時倒平板，冷卻凝固后放入37℃培養(yǎng)箱內24h。無菌落生長方可使用。（2）接種:將含0.5mmol/L組氨酸-0.5mmol/L生物素溶液的頂層瓊脂培養(yǎng)基2.0ml分裝于試管中,45℃水浴中保溫,然后每管依次加入試驗菌株增菌液0.1ml,受試樣品溶液0.1ml和S9混合液0.5ml(需代謝活化時),充分混勻,迅速傾入底層瓊脂平板上,轉動平板,使之分布均勻。水平放置待冷凝固化后，倒置于37℃培養(yǎng)箱里孵育48h。每受試樣品檢測皿加或不加S9混合液均作三個平行皿。（3）對照:每一受試樣品檢測時必須設定陽性物對照，操作過程將加入受試樣品溶液改換為陽性物,其它操作完全相同；同時，每批受試樣品檢測必須設定陰性對照，觀察自發(fā)回變菌落數(shù)。操作過程中不加入受試樣品，其余操作同CompanyLogo結果統(tǒng)計與評價數(shù)據(jù)處理：記錄受試樣品各劑量組、空白對照組自發(fā)回變、溶劑對照組及陽性對照組的每皿回變菌落數(shù)，并求平均值和標準差評價原則：（1）受試樣品的回變菌落數(shù)超過自發(fā)回變菌落數(shù)2倍以上，并呈劑量-效應關系判定檢測結果為陽性。（2）受試樣品經四個試驗菌株檢測后，只要有一個試驗菌株，無論在加S9或不加S9條件下為陽性者時，均可判定該受試樣品Ames試驗結果為陽性。（3）四個試驗菌株在加S９和不加S9條件下均為陰性，且重復試驗結果一致時，則可判定受試樣品Ames試驗結果為陰性。

CompanyLogo鑒定報告內容（1）試驗菌株；（2）代謝活化系統(tǒng)及所用誘導劑；（3）試驗方法、操作步驟、受試樣品檢測劑量分組及陰性、陽性對照名稱；（4）陽性結果評價原則以列表方式報告受試樣品的Aems試驗結果；（5）結論。CompanyLogo1、體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗

適用范圍：本規(guī)范規(guī)定了體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗的基本原則、要求和方法。本規(guī)范適用于檢測化學品可能引起的細胞遺傳學毒性。

CompanyLogo試驗目的

通過檢測受試樣品誘發(fā)體外培養(yǎng)的哺乳動物細胞染色體畸變的能力，從而評價受試樣品的致突變性及其強度。CompanyLogo試驗基本原則

在加入或不加入代謝活化系統(tǒng)的條件下，使培養(yǎng)的哺乳動物細胞暴露于受試樣品中。用中期分裂相阻斷劑（如秋水仙素）處理，使細胞停止在中期分裂相，隨后收獲細胞、制片、染色、分析染色體畸變。CompanyLogo試驗方法

（1）受試樣品固體受試樣品應溶解或懸浮于適合的溶劑中，并稀釋至一定濃度。液體受試樣品可直接使用或予以稀釋。受試樣品應在使用前新鮮配制，否則必須證實儲存不影響其穩(wěn)定性。CompanyLogo劑量水平

受試樣品至少應取3個檢測劑量，檢測范圍建議覆蓋兩個10倍稀釋系列。對有細胞毒性受試樣品，其劑量范圍應包括從最大毒性至幾乎無毒性；當收獲細胞時，最高劑量應能明顯減少細胞計數(shù)或有絲分裂指數(shù)（均應大于50%）；對無細胞毒性或細胞毒性很小的化合物，最高劑量應達到5

l/ml,5mg/ml或0.0lM。應在預試驗中確定細胞毒性和溶解度。測定細胞毒性可使用指示細胞完整性和生長情況的指標，如相對集落形成率或相對細胞生長率等。應在S9系統(tǒng)存在或不存在的條件下測定細胞毒性。對于相對不溶解的物質，當達到不溶解濃度時仍無毒性，則最高劑量應是在最終培養(yǎng)液中溶解度限值以上的一個濃度。在某些情況下，應使用一個以上可見沉淀的濃度，溶解性可用肉眼鑒別，但沉淀不能影響觀察。CompanyLogo陽性對照

可根據(jù)受試樣品的性質和結構選擇適宜的陽性對照物，應是已知的斷裂劑，能引起可檢出的、并可重復的陽性結果。當不存在外源性代謝活化系統(tǒng)時，可使用的陽性對照物有甲磺酸甲酯（methylmethanesulphonate，MMS）、甲磺酸乙脂（ethylmethanesulphonate，EMS）、絲裂霉素C（mytomycinC）、乙基亞硝基脲(ethylnitrosourea，ENU)、硝基喹啉-N-氧化物(4-nitroquinoline-N-oxide)等。當存在外源性活化系統(tǒng)時，可使的陽性對照物有苯并（a）芘（benzo(a)pyrene，BaP）、環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide）等。CompanyLogo陰性對照（1）賦形劑對照:賦形劑應為非致突變物，不與受試樣品發(fā)生化學反應，不影響細胞存活和S9活性。首選賦形劑是水或水溶性溶劑，亦可使用二甲基亞砜（DMSO），但濃度不應大于0.5%。（2）空白對照:如果沒有文獻資料或歷史資料證實所用賦形劑無致突變作用時應設空白對照。CompanyLogo細胞株:可選用中國地鼠肺（CHL）細胞株或卵巢（CHO）細胞株、人或其它哺乳動物外周血淋巴細胞(lymphocyte)。一般推薦使用中國地鼠肺（CHL）細胞株。CompanyLogo試驗步驟細胞培養(yǎng)與染毒試驗需在加入和不加入S9的條件下進行。試驗前一天，將一定數(shù)量的細胞接種于培養(yǎng)皿（瓶）中，放CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。試驗時吸去培養(yǎng)皿（瓶）中的培養(yǎng)液，加入一定濃度的受試樣品、S9混合液（不加S9混合液時，需用培養(yǎng)液補足）以及一定量不含血清的培養(yǎng)液，放培養(yǎng)箱中，根據(jù)細胞周期決定處理2～6h。結束后，吸去含受試樣品的培養(yǎng)液，用Hanks液洗細胞3次，加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，放回培養(yǎng)箱，于24h內收獲細胞。于收獲前2～4h，加入細胞分裂中期阻斷劑（如用秋水仙素，作用時間為4h，終濃度為1

g/ml）。

當受試樣品為原料時，如果在上述加入和不加入S9混合液的條件下均獲得陰性結果，則需加做長時間處理的試驗，即在沒有S9混合液的條件下，使受試樣品與試驗系統(tǒng)的接觸時間延長至24h。當難以得出明確結論時，應更換試驗條件，如改變代謝活化條件、受試樣品與試驗系統(tǒng)接觸時間等重復試驗。CompanyLogo收獲細胞與制片：消化、低滲、固定、滴片、染色、鏡檢CompanyLogo試驗結果評價將結果數(shù)據(jù)按每只動物列表顯示，計算指標包括每個細胞畸變數(shù)、染色體結構異常百分率、各劑量組及對照組不同類型染色體異常數(shù)與頻率等。分裂細胞數(shù)應分別統(tǒng)計，一般不包括在總異常頻率中；若不同性別動物間無差別，各指標可合并統(tǒng)計。所得各組的染色體畸變率用