紫花杜鵑及矮地茶的提取工藝及藥效研究

紫花杜鵑及矮地茶的提取工藝及藥效研究

0紫茶顆粒的高效提取及純化復(fù)合紫茶是由杜鵑和低地茶以1:1的比例混合而成的粉末。濾液是用浸泡過的鹽濃縮的，然后添加糖。這是治療咳嗽和哮喘的經(jīng)典方劑。紫花杜鵑中的黃酮類化合物和低地茶中的巖白菜素是有效的成分。然而，該藥物的活性成分含量低，使用劑量高，治療周期長，給患者帶來不便。根據(jù)該研究中紫茶不適用于高效提取和提取紫茶材料，實現(xiàn)二次開發(fā)。黃酮類化合物和巖白菜素均為醇溶性化合物,其易溶于甲醇、乙醇等有機溶劑,微溶于水.因此,為了提高黃酮類化合物及巖白菜素的提取率,可采用乙醇-水體系作為提取溶劑對紫花杜鵑及矮地茶分別進行提取研究.在單因素實驗的基礎(chǔ)上,通過響應(yīng)面分析及正交試驗研究紫花杜鵑中黃酮類化合物及矮地茶中巖白菜素的最佳醇提取工藝,利用大孔吸附樹脂、氨水除雜及結(jié)晶法分別對黃酮類化合物及巖白菜素提取物進行純化,從而提高紫茶中活性成分的提取率及純度,為開發(fā)高效、速效、服用量少和攜帶方便的中藥新制劑提供參考及依據(jù).1材料和方法1.1儀器和試劑實驗材料:紫花杜鵑(購于廣州致信藥業(yè),為紫花杜鵑帶葉嫩莖)、矮地茶(購于安徽亳州中藥材市場,為矮地茶的干燥葉與帶葉嫩枝)、無水乙醇(AR,成都市聯(lián)合化工試劑研究所)、其他試劑(均為分析純).儀器設(shè)備:紫外可見分光光度計(WFZUV-2102PCS,尤尼柯(上海)儀器有限公司)、恒流泵(BT100-1J,保定蘭格恒流泵有限公司)、自動收集器(BSZ-100,上海滬西分析儀器廠有限公司)、真空干燥箱(DZF-6050,上海一恒科技有限公司)、真空冷凍干燥機(ALPHA2-4,博勵行儀器有限公司).1.2實驗方法1.2.1提取和提取黃酮類化合物1.2.1.紫花植物總黃酮類化合物的提取分別稱取10g紫花杜鵑干燥嫩葉粗粉置于5個250mL錐形瓶中,以乙醇為提取溶劑,選取乙醇濃度為50%、60%、70%、80%、90%,在液料比為6mL/g、8mL/g、10mL/g、12mL/g、15mL/g,提取溫度為40℃、50℃、60℃、70℃、80℃,轉(zhuǎn)速為100r/min的條件下恒溫振蕩,分別提取1次、2次、3次,每次提取時間分別為1h、1.5h、2h、2.5h、3h,提取完畢過濾,合并濾液,采用CH3COOK-Al(Cl)3比色法測定總黃酮含量.在單因素實驗的基礎(chǔ)上,選擇提取次數(shù)為2次,對乙醇濃度、液料比和提取時間對紫花杜鵑中黃酮類化合物的提取效果進行三因素三水平的響應(yīng)面分析,以獲得紫花杜鵑中黃酮類化合物醇提的優(yōu)化工藝.1.2.1.上柱流速及上柱流速選用HPD-600大孔吸附樹脂,對紫花杜鵑黃酮類化合物提取物進行純化,吸附條件為pH值5.8(原液pH),上柱濃度1.0mg/mL,上柱流速4.5mL/min;解吸條件為解吸液采用80%乙醇,解吸流速2mL/min,從第10min開始收集,共收集80mL洗脫液,濃縮蒸干得紫花杜鵑黃酮浸膏.1.2.2巖白菜素提取和提取1.2.2.巖白菜素提取時間的確定分別稱取10g矮地茶干燥嫩葉粗粉置于5個250mL錐形瓶中,以乙醇-水為提取溶劑,選取乙醇濃度為20%、30%、40%、50%、60%,在液料比為6mL/g、10mL/g、12mL/g、15mL/g、20mL/g,提取溫度為40℃、50℃、60℃、70℃、80℃,轉(zhuǎn)速為100r/min的條件下恒溫振蕩,分別提取1次、2次、3次,每次提取時間分別為1h、1.5h、2h、2.5h、3h,提取完畢過濾,合并濾液,采用紫外吸收法測定濾液中巖白菜素的含量.在單因素實驗的基礎(chǔ)上,選擇提取次數(shù)為2次,對提取溶劑乙醇濃度、液料比、提取溫度和提取時間對矮地茶中巖白菜素提取效果的影響進行L9(34)正交試驗,以獲得提取矮地茶中巖白菜素的優(yōu)化工藝.1.2.2.精制巖白菜素的提取和測定巖白菜素英合物的提取將提取所得巖白菜素浸膏加入到乙醇中,攪拌均勻,加氨水,調(diào)節(jié)pH為9~10,有棕色沉淀析出,過濾,反復(fù)3次,合并濾液,加水稀釋并加熱,趁熱濾去不溶物.濾液放置過夜,即有白色結(jié)晶析出,收集結(jié)晶,母液繼續(xù)放置析出更多結(jié)晶,合并結(jié)晶,即得精制巖白菜素.取少量用40%乙醇溶解,用紫外-可見分光光度計測定其吸光度值,計算精制巖白菜素得率及純度.1.2.3關(guān)于藥物效率的研究1.2.3.不同濃度紫花植物葉片、矮地茶巖白菜素的合成空白對照組小鼠灌服等容量的生理鹽水,陽性對照藥選用可待因,分別給藥灌服紫茶顆粒溶液、紫茶藥材水煎煮提取純化物溶液、紫花杜鵑黃酮類化合物提取純化物與矮地茶巖白菜素提取純化物的一定比例混合物(對應(yīng)紫花杜鵑與矮地茶比例為1∶1)溶液,每天一次,連續(xù)灌服7天,于末次給藥30min后將小鼠放入500mL燒杯中,10s內(nèi)逐漸噴入25%的氨水液3mL,立即取出小鼠,觀察和記錄小鼠咳嗽的潛伏期和2min內(nèi)的咳嗽次數(shù),各組小鼠交叉進行,測定抑制率.抑制率=空白組咳嗽次數(shù)均值-給藥組咳嗽次數(shù)均值空白組咳嗽次數(shù)均值×100%1.2.3.不同藥物對呼吸道酚紅排泌量的影響空白對照組灌服等容量的生理鹽水,陽性對照藥選用氯化銨,分別給藥灌服紫茶顆粒溶液、紫茶藥材水煎煮提取純化物溶液、紫花杜鵑黃酮類化合物提取純化物與矮地茶巖白菜素提取純化物的一定比例混合物(對應(yīng)紫花杜鵑與矮地茶比例為1∶1)溶液,通過測定小鼠呼吸道酚紅排泌量判斷藥物對呼吸道分泌液量的影響,測定祛痰指數(shù),從而間接評價藥物的祛痰作用和強度.祛痰指數(shù)=給藥組氣管段酚紅排泌量空白組氣管段酚紅排泌量2結(jié)果與討論2.1紫花植物化合物最佳提取工藝的確定以黃酮類化合物的純度作為考察指標(biāo),采用SAS8e進行統(tǒng)計分析,得到紫花杜鵑中黃酮類化合物純度Y與各因素變量間的函數(shù)關(guān)系為:Y=15.37552+0.169808*X1+0.191607*X2+0.241069*X3-0.781385*X12+0.23125*X1*X2-0.21375*X1*X3-0.090187*X22+0.73875*X2*X3-0.63466*X32其中,X1-乙醇濃度(%),X2-液料比,X3-提取時間(h).將建立的回歸模型中的任一因素固定為零水平,得到另外兩個因素的交互影響作用,二次回歸方程的響應(yīng)面及其等高線如圖1~圖3所示.由圖1可見,乙醇濃度對黃酮類化合物純度的影響更為明顯,當(dāng)乙醇濃度為82%、液料比為12mL/g附近時黃酮類化合物純度達到最高.由圖2可見,隨著乙醇濃度和提取時間的加大,黃酮類化合物的純度先增大而后減小,當(dāng)乙醇濃度為80.54%,每次提取時間為2.2h附近時其純度達到最高.由圖3可見,當(dāng)液料比為12mL/g,每次提取時間為2.2h附近時,黃酮類化合物的純度達到最高,且提取時間對純度的影響大于液料比的影響.由此確定黃酮類化合物最佳提取工藝為:乙醇濃度80%、液料比10mL/g、提取兩次,每次提取時間2.2h.在此條件下,重復(fù)實驗3次,得到紫花杜鵑中黃酮類化合物的提取率平均為96.85%,純度平均為15.42%,與預(yù)測值基本一致,證實了該模型的有效性.2.2紫花植物催化劑的純化對影響大孔吸附樹脂純化效果的因素進行單因素實驗,獲得合理的純化條件,在此基礎(chǔ)上對紫花杜鵑黃酮類提取物進行純化,吸附率可達88.9%,解吸率為93.5%,最終獲得紫花杜鵑黃酮類化合物純度為78.64%,達到了較好的純化效果.2.3最佳提取工藝的確定在單因素實驗的基礎(chǔ)上,確定提取次數(shù)為2次,對提取溶劑乙醇濃度、液料比、提取溫度和提取時間對矮地茶中巖白菜素提取效果的影響進行L9(34)正交試驗.實驗因素水平如表1所示,正交試驗結(jié)果列于表2及表3.在以上提取條件下,以巖白菜素的提取率及純度作為考察指標(biāo)進行分析,確定最佳提取工藝條件.從表2可見,在影響乙醇提取的4個因素中,對巖白菜素提取率影響大小的因素依次為:提取時間>乙醇濃度>提取溫度>液料比,提取率最高的條件為A3B3C1D2;對巖白菜素純度影響大小的因素依次為:乙醇濃度>提取溫度>提取時間>液料比,巖白菜素純度最高的提取條件為A2B1C2D2.從巖白菜素提取率、巖白菜素純度、溶劑用量等方面綜合考慮,確定各因素較優(yōu)的水平組合為A2B1C2D2,即提取溶劑為40%乙醇,液料比為10mL/g,提取溫度為60℃,提取次數(shù)為2次,提取時間為每次2h.按照優(yōu)選出的工藝條件進行提取,結(jié)果巖白菜素的提取率為92.85%,其純度為20.69%.2.4巖白菜素的純化采用氨水除雜及結(jié)晶法,提取所得巖白菜素浸膏經(jīng)精制純化后其純度達到了72.65%,巖白菜素轉(zhuǎn)移率為85.46%,保留了絕大部分活性成分,說明利用乙醇加氨水去除鞣質(zhì),利用巖白菜素的熱水溶性去除脂溶性雜質(zhì),能有效提高巖白菜素的純度.2.5醇-水法純化碳質(zhì)文獻中的活性成分由表3和表4實驗結(jié)果可見,以紫茶顆粒原提取工藝對紫茶藥材采用醇提及醇-水提取兩種藥材中的活性成分,并通過大孔吸附樹脂純化黃酮類化合物,與加氨水除雜法及結(jié)晶法純化矮地茶中巖白菜素的混合物,其止咳祛痰作用均高于原紫茶顆粒,其止咳抑制率為60.