紫花杜鵑干燥葉片中黃酮類化合物的提取及純化研究

紫花杜鵑干燥葉片中黃酮類化合物的提取及純化研究

紫草是杜鵑科植物。干燥的葉子和樹枝的味道略帶辛辣味道，略帶溫暖，可以治療慢性支氣管炎、咳嗽和粘液。廣東省嶺南地區(qū)也有許多慢性支氣管炎、咳嗽和粘液。紫花杜鵑中含有槲皮素(quercetin)、槲皮苷(quereitrin)、金絲桃苷(hyperoside)等多種黃酮類化合物,對哮喘、痰多及支氣管炎有顯著療效,現(xiàn)代藥效學(xué)也表明其中黃酮類化合物為鎮(zhèn)咳化痰有效成分。膜分離技術(shù)是一種使用半透膜的分離方法,如今已廣泛用于海水淡化、純水制造、溶液濃縮、蛋白質(zhì)等溶質(zhì)分離、純化精制等方面[7,8,9,10,11,12,13]。膜分離技術(shù)是借助于人工合成的、具有選擇透過性的膜,利用壓力差、溫度差、電位差作為推動力,基于物質(zhì)能否透過膜或透過膜的速率不同,使流體中各成分得以分離、分級或富集的技術(shù)。其分離過程沒有加熱、冷卻工藝,介質(zhì)沒有溫度變化,不會產(chǎn)生相變;無需使用化學(xué)藥品或添加劑,能保持生物穩(wěn)定性;在液體濃縮的同時,可以兼除小分子物質(zhì)和細菌;由于膜分離技術(shù)具有這些優(yōu)點,特別適用于熱敏性物質(zhì)和生物活性物質(zhì)的處理,在中藥中活性成分的富集純化方面已取得了應(yīng)用。因此,本研究將利用膜分離技術(shù)對紫花杜鵑中黃酮類化合物提取物進行純化。1材料和方法1.1氯化鋁等的合成紫花杜鵑的干燥葉與帶葉嫩枝(紫花杜鵑產(chǎn)地羅定)。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(純度99%);無水乙醇、三氯化鋁、醋酸鉀、醋酸均為分析純;實驗用水為蒸餾水。WFZ-UV-2102PCS型紫外-可見分光光度計尤尼柯(上海)儀器有限公司;MilliporeLabscaleTFF超濾系統(tǒng)德國Millipore公司;3K30超速冷凍離心機博勵行儀器有限公司。1.2方法1.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作準(zhǔn)確稱取在120℃條件下烘至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10.00mg,于燒杯中用甲醇溶解,溶解完畢后轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中,用甲醇定容,搖勻,得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液,質(zhì)量濃度為0.1mg/ml。精密移取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml于20ml容量瓶中,加入2.5%三氯化鋁溶液3.0ml與醋酸鉀溶液(取醋酸鉀9.82g,加適量水使之溶解,加醋酸2.0ml,定容至100ml)5.0ml,用甲醇定容后,放置40min;另取20ml容量瓶加入2.5%三氯化鋁溶液3.0ml與醋酸鉀溶液5.0ml,用甲醇定容作為空白對照液,采用比色法,在420nm波長處測定其吸光度,以吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1,線性回歸方程為y=29.367x+0.0045(R2=0.9995)。1.2.2總黃酮提取率的測定及純度的確定將提取液稀釋至適當(dāng)濃度,準(zhǔn)確吸取稀釋液1ml于試管中,按照1.2.1節(jié)方法進行測定,然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算其濃度C;再按下式計算總黃酮提取率及其純度。式中:C為被測液中蘆丁質(zhì)量濃度(mg/ml);n為稀釋倍數(shù);V為提取液體積(ml);M為原料中總黃酮質(zhì)量(g);m為提取浸膏質(zhì)量(g)。2結(jié)果與分析2.1單因素試驗的結(jié)果和分析2.1.1紫花不同破碎度對提取效果的影響分別稱取紫花杜鵑干燥嫩葉粗粉與干燥嫩葉切片各10g,加入10倍量的水,水煎煮提取3次,每次1h,過濾,合并濾液。依照1.2.1節(jié)分別測定濾液中總黃酮質(zhì)量濃度,由式(1)及式(2)計算黃酮類化合物提取率及其純度,考察紫花杜鵑干燥嫩葉破碎度對提取效果的影響,結(jié)果見表1。以藥材粗粉作為原料,黃酮類化合物的提取率高于藥材切片作為原料,但其純度偏低,說明藥材粉碎后有利于活性成分的浸出,但同時雜質(zhì)成分也隨之浸出,綜合考慮,選用藥材切片作為實驗原料。2.1.2浸泡時間對提取效果的影響稱取紫花杜鵑干燥嫩葉切片10g,加入10倍量的水,水煎煮提取3次,每次1h,過濾,合并濾液;同時取等量的藥材切片,加入10倍量的水,分別浸泡1、2、4h后,加熱回流提取兩次,每次1h,過濾,合并濾液,考察紫花杜鵑干燥嫩葉切片浸泡時間對提取效果的影響,結(jié)果見圖2。由圖2可見,隨著浸泡時間的延長,黃酮類化合物的提取率呈上升趨勢,當(dāng)浸泡時間達到2h時,已接近最高提取率,之后隨浸泡時間的延長,提取率增加不明顯。而其純度在浸泡時間為2h時達到最高值,之后隨浸泡時間的延長而降低。藥材的浸泡使水分子充分進入到藥材內(nèi)部,有利于其中活性成分的浸出,紫花杜鵑干燥嫩葉中含有多種復(fù)雜成分,浸泡時間越長,其他雜質(zhì)成分溶入溶劑中越多,造成活性成分純度迅速降低,綜合考慮,浸泡時間為2h較優(yōu)。2.1.3液料比的影響稱取紫花杜鵑干燥嫩葉切片10g,共稱取4份,分別加入80、100、120、150ml水,即采用液料比分別為8:1、10:1、12:1、15:1(ml/g),浸泡2h后,水煎煮提取3次,每次1h,過濾,合并濾液,考察液料比對提取效果的影響,結(jié)果見圖3。由圖3可見,當(dāng)液料比為12:1(ml/g)時,黃酮類化合物的提取率及其純度均達到最高值。一般來說,溶劑用量越大,藥材浸泡越充分,產(chǎn)生的濃度差越大,有利于有效成分的浸出從而有利于提取。但當(dāng)液料比達到一定程度時,活性成分已經(jīng)基本釋出完全,再增大液料比,提取率基本不增加,其他成分反而會大量溶于溶劑中,導(dǎo)致活性成分純度降低,同時還起到稀釋活性成分的作用,不利于后續(xù)的優(yōu)化步驟。2.1.4提取次數(shù)的確定稱取紫花杜鵑干燥嫩葉切片10g,共稱取4份,加入120ml水,浸泡2h后,分別水煎煮提取1、2、3、4次,過濾,合并每份濾液,考察提取次數(shù)對提取效果的影響,結(jié)果見圖4。由圖4可見,隨著提取次數(shù)的增多,黃酮類化合物的提取率呈增大趨勢,但當(dāng)提取次數(shù)為3次后,其純度明顯下降,說明提取次數(shù)為3次時,黃酮類化合物已基本完全浸出。2.1.5提取時間的影響稱取紫花杜鵑干燥嫩葉切片10g,共稱取4份。加入120ml水,浸泡2h后,水煎煮提取兩次,提取時間分別為每次0.5、1、1.5、2h,合并每份濾液,考察提取時間對提取效果的影響,結(jié)果見圖5。由圖5可見,隨著提取時間的延長,黃酮類化合物的提取率不斷增高,提取時間大于1h后,提取率增長速度緩慢;提取時間為1h時,其純度最高,繼續(xù)增加提取時間反而下降?？梢娞崛r間為1h,紫花杜鵑干燥嫩葉中活性成分已基本浸出。2.2不同因素對茬細胞提取的優(yōu)化在以上單因素試驗的基礎(chǔ)上,選用紫花杜鵑干燥嫩葉切片為原料,在浸泡2h的條件下,對液料比、提取次數(shù)和提取時間對紫花杜鵑干燥嫩葉活性成分的提取效果的影響進行了L9(34)正交試驗(表2),以獲得紫花杜鵑干燥嫩葉中活性成分提取的優(yōu)化工藝,結(jié)果見表3。由表3可見,液料比、提取次數(shù)和提取時間對黃酮類化合物的提取率及純度均有較大影響,其中對提取率的影響大小順序依次是提取時間>提取次數(shù)>液料比,提取率最高的條件均為A2B3C3,對純度影響大小的順序依次是提取次數(shù)>液料比>提取時間,純度最高的條件為A2B2C1。從活性成分提取率、純度、溶劑用量、工作效率等方面綜合考慮,確定各因素較優(yōu)的水平組合為A2B2C2,即液料比為12:1、提取次數(shù)為3次、每次1h。稱取藥材切片10g,浸泡2h后,按照優(yōu)選出的工藝條件進行提取,重復(fù)3次,結(jié)果黃酮類化合物平均提取率及純度分別為97.58%和13.95%。2.3膜分離技術(shù)對紫花杜鵑干燥葉片中的黃酮類化合物進行了探討2.3.1離心分離法提取液中含有較多的固體雜質(zhì)和相對分子質(zhì)量較大的膠體、多糖和淀粉等,在進行中藥膜分離時可能會造成膜的污染,降低膜通量,縮短膜的使用壽命,因此在膜分離前采用離心分離法去除紫花杜鵑干燥嫩葉提取液中的固體雜質(zhì)。將提取液放入500ml的離心管中,調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為10000r/min,高速離心30min,濾液作為過膜分離供試液。2.3.2膜分離技術(shù)對紫花不同提取液的純化效果取經(jīng)過預(yù)處理的黃酮提取液,利用膜分離技術(shù)進行純化?？刂茐毫?.35MPa,分別通過截留相對分子質(zhì)量為105、5×104、104、5×103的膜,當(dāng)提取液濃度較大,壓力升高時,加等倍量的水稀釋,如此反復(fù)3次。采用紫外-可見分光光度計測定透過液中所含黃酮類化合物的濃度,考察膜分離技術(shù)對紫花杜鵑干燥嫩葉提取液的純化效果,結(jié)果見表4。由表4可見,通過不同截留分子量的膜處理后,浸膏得率明顯下降,用截留相對分子質(zhì)量為5×103的膜過濾后,黃酮類化合物的透過率僅為59.15%,透過率偏低;若直接采用截留相對分子質(zhì)量為104的膜處理,提取液透過速度緩慢,延長實驗周期,表明截留相對分子質(zhì)量為105及5×103的膜可以有效去除紫茶提取液中大分子物質(zhì),因此,選擇將提取液依次通過截留相對分子質(zhì)量為105、5×104、104三種膜。當(dāng)提取液透過截留相對分子質(zhì)量為104的膜后,黃