京尼平交聯(lián)膠原殼聚糖復(fù)合多孔支架的制備及生物相容性研究

京尼平交聯(lián)膠原殼聚糖復(fù)合多孔支架的制備及生物相容性研究

由于這種組織的良好適應(yīng)性和可分解性，許多組織工程領(lǐng)域都進(jìn)行了開發(fā)。但由于其機(jī)械強(qiáng)度不足,在體內(nèi)水解過程中不能保持空間構(gòu)型,且吸收過快,因此,在應(yīng)用時(shí)常加入殼聚糖等成分,以提高支架的彈性模量、臨界形變和強(qiáng)度。交聯(lián)可進(jìn)一步提高支架的機(jī)械強(qiáng)度和抗蛋白酶降解的能力。但物理交聯(lián)法交聯(lián)度較低且不均一,而化學(xué)交聯(lián)法采用戊二醛、甲醛等傳統(tǒng)的交聯(lián)劑,易引起中毒或不良反應(yīng)。京尼平是一種提取自梔子果實(shí)的天然交聯(lián)劑,其毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)的化學(xué)交聯(lián)劑。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明其毒性低于戊二醛104倍,而細(xì)胞增殖能力高于戊二醛組5×103倍。但是既往對(duì)于京尼平的研究多集中于單一材料,且多關(guān)注交聯(lián)時(shí)間及交聯(lián)劑濃度對(duì)于材料交聯(lián)的影響,而觀察交聯(lián)溫度對(duì)京尼平交聯(lián)復(fù)合支架影響的研究未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬通過觀察支架孔徑、交聯(lián)度、降解率、溶脹率、細(xì)胞毒性及組織相容性的變化,探討交聯(lián)溫度對(duì)京尼平交聯(lián)膠原/殼聚糖復(fù)合支架的影響。1材料和方法1.1化學(xué)試劑及試劑殼聚糖(WOLSEN),鼠尾膠原,京尼平(和光純藥工業(yè)株式會(huì)社),甘氨酸(solarbio),冰醋酸、異丙醇、乙二醇甲醚、茚三酮均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。DMEM培養(yǎng)基(gibco),胎牛血清(hyclone),胰蛋白酶(sigma),冷凍干燥機(jī)(CHRIST),倒置相差顯微鏡(nikon),分光光度計(jì)(HITACHl),掃描電鏡(HITACHl)。1.2膠原/殼聚糖復(fù)合支架的制備配制0.2mol/L的醋酸溶液,分別稱取一定質(zhì)量的殼聚糖和膠原粉末,將其完全溶解于稀醋酸溶液中,靜置脫除溶液中的氣泡。將兩種溶液按一定比例混合,充分?jǐn)嚢杌旌暇鶆?。將膠原、殼聚糖混合液注入模具中,置于冷凍柜中-20℃冷凍成型,樣品完全凍結(jié)后冷凍干燥12h,制得膠原/殼聚糖復(fù)合支架。將上述支架于風(fēng)箱中揮發(fā)殘留醋酸后,置于0.5%的京尼平水溶液中,分別于4℃、20℃、36℃交聯(lián)24h后,蒸餾水沖洗后置于飽和甘氨酸溶液中浸泡,換液至溶液不再變色后用蒸餾水反復(fù)沖洗,重新冷凍干燥。1.3掃描電子觀察將樣品裁剪成直徑4mm高2mm大小的小片,真空噴金后,掃描電鏡觀察表面結(jié)構(gòu)和孔徑變化,選擇合適的放大倍數(shù)拍攝掃描照片。1.4自由氨基酸測(cè)定參照Mi的方法采用茚三酮法測(cè)定交聯(lián)度。具體為:①1.05g的檸檬酸和10ml(1.0mol/L)的NaOH和0.04g的氯化亞錫(SnCl2·2H2O)混合,加去離子水調(diào)至25ml,另將1g的茚三酮加入25ml乙二醇甲醚中,再將上述兩液體混合攪拌45min,制成茚三酮溶液,避光保存。②稱取樣品,加入4ml茚三酮溶液,100℃水浴20min,冷卻至室溫,加20ml50%異丙醇溶液,用分光光度計(jì)在570nm下測(cè)量吸光度。用甘氨酸溶液做標(biāo)準(zhǔn)曲線,并通過此標(biāo)準(zhǔn)曲線查找各樣本中自由氨基酸的摩爾數(shù)。所有反應(yīng)均在暗室進(jìn)行。以Mo表示未加京尼平的相應(yīng)支架中含自由氨基酸摩爾數(shù),Mt表示各組交聯(lián)樣品中氨基酸摩爾數(shù),按以下公式計(jì)算各組材料的交聯(lián)度:交聯(lián)度=(Mo-Mt)/Mo×100%。1.5環(huán)氧乙烷消毒法各組受試材料分別稱重(Wo),將材料放回離心管中封裝好,環(huán)氧乙烷消毒,然后加25mlPBS溶液,3d換液1次,1,2,4周取出,蒸餾水反復(fù)沖洗后再次凍干后稱重(Wt)。降解率=(Wo-Wt)/Wo×100%。1.6支架溶脹率測(cè)定稱取支架在干態(tài)時(shí)的質(zhì)量為Wo,然后將支架在PBS中浸泡24h后小心取出,用濾紙吸干表面的水分,稱重為Wt,則支架溶脹率=(Wt-Wo)/Wo×100%。1.7細(xì)胞培養(yǎng)組合將京尼平交聯(lián)的膠原/殼聚糖切成直徑4mm高2mm大小,Co60照射消毒。參照胡聲鎖等的方法制備兔成體脂肪干細(xì)胞,消化狀態(tài)較好處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的兔脂肪干細(xì)胞調(diào)整濃度至1×106/ml,負(fù)壓接種于支架上,在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下孵育4h后將細(xì)胞支架復(fù)合體置入96孔板,每孔加入培養(yǎng)液200μl,設(shè)為實(shí)驗(yàn)組。將細(xì)胞以密度為1×104/ml直接接種于96孔板,每孔200μl,設(shè)為對(duì)照組。另將單純材料加入96孔板,每孔加入培養(yǎng)液200μl,設(shè)為實(shí)驗(yàn)調(diào)零組,空白孔加入培養(yǎng)液200μl,設(shè)為對(duì)照調(diào)零組。在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下孵育,培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),隔天換液。培養(yǎng)1、3、5、7、14dMTT法檢測(cè)細(xì)胞活力,實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組分別以對(duì)應(yīng)的調(diào)零組調(diào)零,以計(jì)算其相對(duì)增殖率,評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性。1.8術(shù)后皮膚組織病理學(xué)觀察新西蘭兔6只(體重1.5～2kg),速眠新Ⅱ肌注麻醉后,無菌條件下切開雙側(cè)股部皮膚,分離肌肉組織,每側(cè)分別植入支架材料,不可吸收縫線縫合,觀察動(dòng)物術(shù)后一般情況和傷口情況,于手術(shù)后2周、4周后處死動(dòng)物,取材料連同周圍組織,10%甲醛固定,石蠟包埋切片,HE染色光鏡觀察。1.9統(tǒng)計(jì)處理用SPSS11.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,樣本均數(shù)間比較使用方差分析。P<0.01具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1膠原/殼聚糖支架孔經(jīng)凍干制得的膠原/殼聚糖支架為乳白色,有彈性,較柔軟,交聯(lián)后的支架為深藍(lán)色,隨著交聯(lián)溫度的提高,其顏色逐漸加深。圖1示,凍干的膠原/殼聚糖支架孔隙豐富,大小比較均一,且孔與孔之間相互聯(lián)通構(gòu)成了交通孔。支架交聯(lián)后的孔隙結(jié)構(gòu)無明顯變化。2.2組與4組比較表1示,隨交聯(lián)溫度升高,三組交聯(lián)組支架交聯(lián)度升高。20℃組達(dá)到了67.69%、36℃組達(dá)到了70.32%,與4℃組比較有顯著差異(P<0.01)。而20℃組和36℃組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。2.3組降解率比較2周時(shí)只有4℃組有少量降解,4周時(shí)交聯(lián)組均有少量降解,與未交聯(lián)組比較均有顯著差異(P<0.01),且0℃組和36℃組降解率較4℃組明顯降低(P<0.01)。而20℃組和36℃組之間無明顯差異(P>0.05)。2.4不同市售血壓是否促使溶脹率比較見表1交聯(lián)后支架溶脹率較未交聯(lián)組明顯降低(P<0.01),且隨著交聯(lián)溫度的升高,溶脹率均有所降低,但各交聯(lián)組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。2.5細(xì)胞毒性依照表2評(píng)判標(biāo)準(zhǔn),各組材料均表現(xiàn)出較低的細(xì)胞毒性,提示交聯(lián)后材料均為合格的組織工程支架材料。2.6皮膚組織病理學(xué)所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物手術(shù)后飲食活動(dòng)正常,傷口一期愈合,植入?yún)^(qū)局部皮膚無紅腫、破潰及材料外露。組織學(xué)觀察,可見支架材料周圍無組織變性及壞死現(xiàn)象,未見明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn),2周及4周組均維持多孔樣結(jié)構(gòu),無明顯材料降解。3京尼平雙向交聯(lián)對(duì)支架結(jié)構(gòu)的影響文獻(xiàn)報(bào)道,膠原/殼聚糖復(fù)合凍干支架具有三維立體多孔結(jié)構(gòu),可模擬天然軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的化學(xué)構(gòu)成,理論上應(yīng)該是一種較為理想的組織工程軟骨支架。但由于上述支架有一定的壓縮性,在體內(nèi)水解過程中不能保持空間構(gòu)型并且吸收過快,因此為了達(dá)到組織工程應(yīng)用所要求的參數(shù),如變性溫度、機(jī)械強(qiáng)度和抗蛋白酶降解的能力等,在使用前需進(jìn)行交聯(lián)。本實(shí)驗(yàn)用天然交聯(lián)劑京尼平對(duì)膠原/殼聚糖支架進(jìn)行交聯(lián),希望在提高生物材料抗降解能力的同時(shí),保留其良好生物相容性。但膠原等生物材料在較高溫度下容易變性,從而喪失部分生物活性,因此本實(shí)驗(yàn)選擇在可以保持材料生物活性的較低溫度段,取等距離的3個(gè)溫度點(diǎn):4℃、20℃、36℃,進(jìn)行研究?，F(xiàn)多認(rèn)為大小合適,孔徑均勻且有合適的交通孔是構(gòu)建組織工程支架的重要要求,而對(duì)于軟骨組織工程支架,廣泛存在的較大的交通孔有利于軟骨細(xì)胞和基質(zhì)的產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的支架材料孔徑約為200μm,可見廣泛存在的較大交通孔,利于細(xì)胞的生長(zhǎng)及營(yíng)養(yǎng)和代謝產(chǎn)物的輸送。本研究結(jié)果顯示交聯(lián)組支架孔徑形態(tài)大小較未交聯(lián)支架無明顯變化,分析可能是因?yàn)榫┠崞浇宦?lián)是在支架結(jié)構(gòu)形成的基礎(chǔ)上進(jìn)行的。而凍干支架孔徑的大小主要取決于冷凍過程中形成冰晶的大小,和冷凍溫度以及降溫速度密切相關(guān)。因此在本研究中,各組支架孔徑的大小主要取決于冷凍溫度以及降溫速度,而交聯(lián)組支架經(jīng)過二次凍干,孔徑結(jié)構(gòu)更為均一。本研究發(fā)現(xiàn),交聯(lián)溫度的升高可以促進(jìn)混合支架交聯(lián)度的提高,20℃、36℃組較4℃組均有明顯提高,達(dá)到較高交聯(lián)度,而20℃組和36℃組交聯(lián)度無明顯差異。結(jié)果表明,交聯(lián)溫度的升高可以增加分子運(yùn)動(dòng)速率從而顯著提高交聯(lián)速率,而隨著交聯(lián)的進(jìn)行,自由氨基逐漸減少,使得在交聯(lián)度達(dá)到較大值后,交聯(lián)過程減慢,因此交聯(lián)溫度的進(jìn)一步升高,并未顯著提高交聯(lián)度。膠原和高脫乙酰度的殼聚糖均有良好的生物降解性,兩者共混制得的材料也因兩者的比例不同表現(xiàn)出相應(yīng)的降解率。京尼平交聯(lián)大大減緩了支架材料的降解,各組交聯(lián)材料均表現(xiàn)出了較未交聯(lián)組高的抗降解能力。20℃、36℃組的抗降解能力較4℃組的明顯提高,而20℃組和36℃組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表現(xiàn)了和交聯(lián)度變化相似的趨勢(shì)。Bigi報(bào)道了交聯(lián)可以顯著降低支架材料的溶脹率,在本實(shí)驗(yàn)中也可看出同樣的趨勢(shì)。而溶脹率的大小不僅和材料的性質(zhì)相關(guān),而且同樣受支架結(jié)構(gòu)的影響。在本實(shí)驗(yàn)中,各組支架結(jié)構(gòu)無明顯區(qū)別,這可能是各交聯(lián)組之間溶脹率無顯著差異的原因。細(xì)胞毒性試驗(yàn)是反映材料生物相容性的一個(gè)重要指標(biāo),本實(shí)驗(yàn)中,交聯(lián)后材料對(duì)細(xì)胞增殖無明顯影響,細(xì)胞毒性級(jí)別為0、1級(jí),表明交聯(lián)后材料具有良好的細(xì)胞相容性。體內(nèi)埋置實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)本支架材料能夠很好的被宿主接受,無材料排異、過敏反應(yīng)等不良結(jié)果發(fā)生;組織切片結(jié)果表明,該支架材料無明顯炎癥反應(yīng)及異物反應(yīng),能與植入部位組織很好的相容,表明具有良好的組織相容性。這也可能是京尼平毒性較低及交聯(lián)后生物材料抗原表位暴露減少的原因。此外,該支架材料在體內(nèi)的降解吸收不顯著,且能維持三維空間結(jié)構(gòu),提示交聯(lián)大大緩解了膠原/殼聚糖支架的降解,更好地穩(wěn)定了支架的結(jié)構(gòu)。但是細(xì)胞接種后表型維持以及修復(fù)軟骨損傷的效果還有待進(jìn)一步研究?？山到庑院蜕锵?/p>