微生物溶菌酶的酶學(xué)性質(zhì)及抑菌性分析

微生物溶菌酶的酶學(xué)性質(zhì)及抑菌性分析

溶菌酶，又稱異質(zhì)醇胞壁酶或多酚醛基總理酪氨酸酶，是一種堿性酶，能溶解細菌細胞中的糖苷含量，并能溶解微生物細胞。這是該酶的抗菌、消炎和抗菌作用。根據(jù)溶菌酶的一級結(jié)構(gòu)、分子量和生物來源,可以將溶菌酶分為6種類型,即:噬菌體T4溶菌酶(phage-type)、植物溶菌酶(plant-type)、微生物溶菌酶(bacteria-type)和3種動物型溶菌酶,即溶菌酶C型(chicken-lysozymetype)、G型(goose-type)和I型(invertebrate-type)。目前已經(jīng)商業(yè)化應(yīng)用的溶菌酶多由蛋清中提取,其最適作用溫度為50℃,最適pH值為7.0,當(dāng)pH值在1.2～11.3范圍內(nèi)劇烈變化時,依然能保持較高的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性及熱穩(wěn)定性,已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品等行業(yè)。但該酶主要溶解革蘭氏陽性菌,因而限制了它的進一步應(yīng)用,且國內(nèi)蛋清溶菌酶年產(chǎn)量不足50t,特別是高活性的溶菌酶供應(yīng)還不能滿足日益增長的需求。微生物溶菌酶的研究和應(yīng)用尚處于起步階段,但因其較高的提取率、廣泛的溶菌譜和優(yōu)越的抑菌性,正日益受到研究人員的重視。微生物產(chǎn)溶菌酶主要有3種:N-乙酰己糖胺酶、酰胺酶、內(nèi)肽酶。在微生物的發(fā)酵液中往往存在許多溶菌作用相關(guān)因子,由于彼此之間的協(xié)同作用使其對細胞壁的溶菌能力增強。微生物溶菌酶純品為白色、微黃或黃色晶體或不定型粉末,無臭,味甜,易溶于水,不溶于丙酮、乙醚等有機溶劑。本試驗采用微生物來源的溶菌酶,通過對溶菌酶酶學(xué)性質(zhì)的研究及體外抑菌試驗,為溶菌酶在畜禽疾病治療、促進生長等方面的應(yīng)用提供參考。1材料和方法1.1材料表面1.1.1微生物溶菌酶溶菌酶檢測試劑盒(南京建成科技有限公司生產(chǎn));微生物溶菌酶(5000U/mg,上海沈李科工貿(mào)有限公司生產(chǎn));營養(yǎng)瓊脂、十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉、檸檬酸(國藥集團生產(chǎn))。1.1.2精密ph的測定UV-2000尤尼柯UNIC紫外可見分光光度計;THZ-82水浴恒溫振蕩器;SE402F電子天平;PB-10精密pH計;高壓滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)、移液器等。1.1.3菌種菌種溶壁微球菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、嗜水氣單胞菌、哈維氏菌、沙門氏菌、啤酒酵母、黑曲霉及青霉均為實驗室保存菌種。1.2測試方法1.2.1ph值對微生物酶的影響將0.1mol/L檸檬酸溶液和0.1mol/L磷酸氫二鈉溶液按一定比例混合,分別配制成pH值為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的緩沖液;以無菌水配制1g/L的微生物溶菌酶溶液,進行酶活測定。以其中的最高酶活為100%,其他條件下的酶活占最高酶活的百分數(shù)即為相對酶活。1.2.2ph值緩沖液下最適ph值緩沖液酶活測定調(diào)節(jié)恒溫水浴鍋,分別設(shè)定反應(yīng)溫度為30、35、40、45、50、55、60、65、70℃,在最適pH值緩沖液下測定酶活,以最高酶活為100%,其他條件下的酶活占最高酶活的百分數(shù)即為相對酶活。1.2.3ph值緩沖液的制備稱取1.000g溶菌酶,以對應(yīng)的最適pH值的緩沖液定容到1L,分別在40、50、60、70、80、90℃的水浴鍋中各預(yù)熱2支盛有1.9mL最適pH值緩沖液的試管。然后分別加入0.1mL的溶菌酶溶液,迅速搖勻并準確計時2min和5min,取出后迅速置于冰水浴中,于最適pH值和溫度條件下測定酶活,以未經(jīng)高溫處理的稀釋酶樣酶活為100%,其他條件下的酶活占未處理酶樣酶活的百分數(shù)即為相對酶活。1.2.4ph值對酶活的影響稱取1.000g溶菌酶樣品,加入1L無菌水,攪拌均勻,在最適pH值和最適溫度條件下測定酶活作為對照。取0.1mL溶菌酶溶液(1g/L)12份,分別加入1.9mL的緩沖液,將pH值分別調(diào)到2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0,于40℃水浴鍋中保溫2h,迅速取出放入冰水浴,分別于最適pH值和溫度條件下測定酶活。以對照組所測得的酶活為100%,其他條件的酶活占對照組酶活的百分數(shù)即為相對酶活。1.2.5微生物溶菌酶活性測定將各供試細菌在營養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)24h,啤酒酵母與霉菌孢子于液體土豆培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h后,振蕩均勻,在無菌操作下,分別取150μL菌液與15mL固體培養(yǎng)基制成傾注平板,貼上滅菌的圓濾紙片。各取5μL濃度分別為0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.1、1.5、2.0mg/mL的微生物溶菌酶溶液,滴加在濾紙片上,37℃培養(yǎng)24h,測定最低抑制濃度。每個菌種試驗平行3次。2結(jié)果與分析2.1ph值對微生物溶菌酶活性的影響在37℃、不同pH值的緩沖液中測定的酶活見圖1。由圖1可以看出,微生物溶菌酶隨著pH值的不斷增大,酶活呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,在pH值5.0～7.5之間可保持80%以上的酶活。而在pH值7.0左右的時候達到了最高峰,因此微生物溶菌酶的最適pH值為7.0。2.2反應(yīng)體系溫度對微生物溶菌酶活性的影響調(diào)整各個微生物溶菌酶溶液pH值為7.0,在不同溫度下測得的酶活變化情況見圖2。由圖2可以看出,微生物溶菌酶的酶活隨著反應(yīng)體系溫度的上升,呈現(xiàn)了一個先上升后下降的趨勢,原因是起初溫度的上升加快了分子運動,使反應(yīng)速度隨之提高,而達到40℃后,隨溫度的升高,溶菌酶逐漸失活,引起酶催化活性的下降。故該酶的最適反應(yīng)溫度為40℃。2.3in后酶活變化微生物溶菌酶溶液經(jīng)由不同溫度分別處理2min及5min后,酶活變化曲線如圖3。由圖3可以看出,微生物溶菌酶在濕熱處理2min后酶活基本不變,而濕熱處理5min后,溫度低于75℃時,仍可保持80%以上的酶活。2.4酶活變化曲線微生物溶菌酶經(jīng)由不同的pH值條件處理2h之后,酶活變化曲線見圖4。由圖4可以看出,在各pH值環(huán)境中處理2h后,微生物溶菌酶在pH值2.5～6.0左右的酶活,保持在100%以上,較穩(wěn)定。2.5革蘭陰性菌對微生物的抑制作用利用濾紙片擴散法測定了不同濃度的微生物溶菌酶對8種細菌及3種真菌的最低抑制濃度(表1)。由表1可知,微生物溶菌酶不僅對革蘭氏陽性的溶壁微球菌、金黃色葡萄球菌具有較強的抑制作用,對大腸桿菌、哈維氏菌、溶藻弧菌、沙門氏菌等陰性菌也具有很強的抑制作用,尤其是嗜水性氣單胞菌對該微生物溶菌酶最為敏感,最低抑制濃度為0.005mg/mL,而對副溶血弧菌較不敏感。此外,對啤酒酵母也有抑制作用,最低抑制濃度為2.0mg/mL。表明微生物溶菌酶具有廣譜抑菌性,并且對革蘭氏陰性菌(G-)具有比革蘭氏陽性菌(G+)更強的抑制效果。這可能是因為微生物溶菌酶與革蘭氏陰性菌外層成分的脂多糖無親和性從而無法阻止溶菌酶的滲透,并且革蘭氏陰性菌肽聚糖層薄,因而溶菌酶能很好地水解革蘭陰性菌細胞壁并抑制其生長。此外,該微生物溶菌酶對啤酒酵母也具有一定的抑制效果,而對黑曲霉和青霉無抑制作用。3微生物溶菌酶的溫度及時間(1)微生物溶菌酶的最適作用pH值:溶菌酶隨著pH值的不斷增大,酶活是呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,在pH值5.0～7.5之間可保持80%以上的酶活,而在pH值7.0左右酶活達到最高峰。(2)微生物溶菌酶的最適作用溫度:溶菌酶的酶活隨著反應(yīng)體系溫度的上升呈現(xiàn)了一個先上升后下降的趨勢,到達40℃左右的時候酶活達到最高,超過40℃后酶活則開始下降,該酶的最適反應(yīng)溫度為40℃。(3)微生物溶菌酶的濕熱穩(wěn)定性:微生物溶菌酶溶液濕熱處理2min后酶活基本不變,而濕熱處理5min后,溫度低于75