啤酒廢酵母中cuzn-sod的提取與應(yīng)用

啤酒廢酵母中cuzn-sod的提取與應(yīng)用

sod是超氧化物化學(xué)酶的縮寫（ecl.15.1.1）。在化妝品市場上，尤其引人注目，如大寶、霞飛、奧琪、隆力奇等名牌都冠之為SOD面蜜。在啤酒行業(yè)也有“SOD”啤酒。作為功能性食品基料的SOD，在食品、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)愈來愈成為市場的搶手貨，需求量大，經(jīng)濟(jì)效益顯著。目前僅從牲畜動(dòng)物血中提取，受到原料來源的限制，且質(zhì)量不穩(wěn)定。我國啤酒年產(chǎn)量已達(dá)2300萬噸以上，副產(chǎn)物啤酒廢酵母泥也達(dá)46萬噸左右，倘若從部分啤酒廢酵母泥中提取開發(fā)SOD，不僅作為商品供應(yīng)市場，且自產(chǎn)自制SOD啤酒，既不必從外購買SOD，又開發(fā)了創(chuàng)新產(chǎn)品增效創(chuàng)收。因此，這是一條利國利民的好路子，本文介紹幾種工藝方法供參考。1發(fā)酵活性物質(zhì)SOD是重要的氧自由基清除劑，廣泛存在于自然界動(dòng)植物、微生物中的金屬酶。SOD有3種，其中對Cu·Zn-SOD研究得較透徹，人們從技術(shù)上已能制造出純凈的SOD產(chǎn)品?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)實(shí)踐證明，SOD對人體超氧負(fù)離子自由基（Superoxideanionadicalo2）的氧化性損傷發(fā)揮著有效的清除作用和生理效能。因此它能延緩衰老，提高人體免疫力，預(yù)防和治療一些疾病，是最具臨床價(jià)值的治療酶。SOD是大分子生物活性物質(zhì)，我國中醫(yī)理論素有“藥食同源”的說法，SOD經(jīng)口攝入能否被人體吸收并起到應(yīng)有的保健作用呢？這方面經(jīng)研究結(jié)果證明還是有效的。因此，僅從功能性食品基料這個(gè)市場分析，其良好的效果和應(yīng)用范圍，仍在不斷擴(kuò)大。從啤酒廢酵母中提取Cu·Zn-SOD較之從其它動(dòng)物血液中提取的最大特點(diǎn)是不存在抗原反應(yīng)，成本低。啤酒企業(yè)的管理者可就地取材，產(chǎn)品緊俏，效益可觀，何樂而不為呢？2從啤酒中提取sod的一些工藝方法2.1萃取離心法2.1.1工具木的制備將回收的啤酒廢酵母泥用2～3倍的無菌冷水（0.5℃～2℃）洗滌，用80目～100目的不銹鋼孔板篩過濾，除去酒花樹脂等雜質(zhì)。離心分離后，再用0.5℃～2℃無菌冷水清洗1～2次，直到所得上層清液無色無味，酵母呈純白色為止。2.1.2萃取劑萃取劑可采用甲苯、乙醇-氯仿、異丙醇等。實(shí)驗(yàn)證明其中以“異丙醇法”破壁提取，酵母中SOD的粗提液總酶活力最高，故介紹此法。2.1.3丙酮sod的提取、沉淀及沉淀將預(yù)處理過的酵母泥加入異丙醇（異丙醇濃度為90%，酵母泥:異丙醇=9:1），浸泡120min，抽濾出異丙醇。再加入3倍體積50mmoL/L磷酸鉀緩沖液（pH=7.0），攪拌120min，離心除去菌體，即得SOD粗提液。用2moL/LHCl調(diào)節(jié)SOD粗提液至pH=5.0，加入丙酮（溫度4℃～10℃，pH=5.0）攪拌均勻?yàn)橹?，使丙?粗酶液(v/v)=0.8:1（此時(shí)雜蛋白沉淀最多），5000r/min離心，除去沉淀雜蛋白，調(diào)節(jié)上清液pH至4.0（為SOD的等電點(diǎn)），加丙酮（控制其溫度為4℃～10℃），使丙酮:SOD清液(v/v)=0.3:1，此時(shí)SOD沉淀的酶比活最高，達(dá)3048u/mg。經(jīng)丙酮2次分級(jí)沉淀純化SOD，回收率達(dá)73%，純化倍數(shù)達(dá)96倍。2.2分階段萃取法2.2.1啤酒廢水母配方的預(yù)處理預(yù)處理方法及步驟同2.1.1。2.2.2檸檬酸三鈉2h2o甲：0.2mol/L檸檬酸（42g檸檬酸·H2O/L）。乙：0.2mol/L檸檬酸三鈉·2H2O(58.8g/L）。甲、乙體積比為0.1:4.5，此混合溶液pH=6.2，再用少量NaAc飽和溶液仔細(xì)調(diào)整pH至7.4～7.8范圍內(nèi)。2.2.3萃取效率的考察將洗凈并預(yù)處理過的酵母泥（最好再經(jīng)過復(fù)壯）在充分?jǐn)嚢柘乱来蔚丶尤朐系?.34倍上述萃取液和1倍量事先備好的6.5%NaCl溶液，劇烈攪拌30min以上，注意pH應(yīng)維持在7.6，以保證萃取效果，從而保證SOD回收率。2.2.4澄清液充分?jǐn)嚢枭鲜鲚腿∫海⒕従徏尤胧孪扰渲坪玫倪m量CuCl2飽和溶液（用量比例每100L原料加40gCuCl2飽和溶液）。混合均勻后用水浴加熱至68℃，恒溫30min，急冷至室溫，精細(xì)過濾，收集濾液。此時(shí)應(yīng)得到澄清的濾液，不澄清應(yīng)重新精細(xì)過濾。將澄清透明的濾液用少量乙酸鈉(NaAc)飽和溶液精細(xì)調(diào)整其pH為4.8～5.2。置于事先準(zhǔn)備好的冰鹽水混合浴中，使其冷卻到0℃以下，然后在充分?jǐn)嚢柘录尤?～2倍丙酮（0℃～4℃）即析出大量沉淀。低溫下靜置，抽濾得沉淀物后，將其復(fù)溶于適量純水中，仔細(xì)過濾除去不溶物得清液。在清液中再加入0.75～1倍體積的冷丙酮，經(jīng)0℃靜置，抽濾得沉淀，真空冷凍干燥即得到呈淡藍(lán)綠色粉末的SOD粗品，比活值可達(dá)3000u/mg以上。2.2.5sod的提取粗品SOD溶于pH7.6,2.5mol/LK2HPO4-KH2PO4緩沖溶液中，經(jīng)超濾得澄清液，將清液上DEAE-SephadexA-50層析柱(φ7.5cm×40cm)，該柱事先用上述緩沖液平衡，流速應(yīng)控制在100mL/h～200mL/h。上樣至飽和后，用同一緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，流速為100mL/h～120mL/h。仔細(xì)地通過取樣監(jiān)測SOD活性的蛋白峰，紫外光吸收的光密度最大值Cu·Zn-SOD為258nm，可見光為680nm。將上述過程中收集的SOD洗脫液裝入透析袋中，在蒸餾水中析出鹽后，將透析液超濾濃縮，減壓冷凍干燥即得到外觀帶淡藍(lán)綠色的，酶比活達(dá)到10000u/mg，分子量（相對分子量）3.2×104，亞基分子量1.6×104的精品SOD。本法較之離心萃取法雖手續(xù)繁瑣，但不用離心機(jī)，收率高，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，經(jīng)濟(jì)效益顯著。2.3低耗高效技術(shù)本法是有待開發(fā)的創(chuàng)新技術(shù)，膜分離技術(shù)是本世紀(jì)高科技邊緣學(xué)科，分離過程中不存在化學(xué)反應(yīng)，可避免物料受熱破壞，高效低耗是膜技術(shù)的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)。SOD是生物大分子的活性物質(zhì)，分子量（絕對分子量）約5.3123×10-23kg，利用微濾超濾法提取SOD，工藝上具有無相變、低溫、活性損失小、回收率高、操作簡單等特點(diǎn)。2.3.1提取液的制備將處理過的復(fù)壯后的酵母泥在pH偏堿性的條件下，經(jīng)均質(zhì)機(jī)打成勻漿，加水浸提，將提取液經(jīng)10um、0.1um膜2次微濾后，去除微小雜質(zhì)。然后先用1.32808×10-22kg分子量的超濾膜截留大分子物質(zhì)，收取透過液，再用1.6601×10-23kg分子量的超濾膜截留SOD。2.3.2sod的制備工藝參數(shù)：超濾壓差0.25MPa～0.3MPa；循環(huán)速度以達(dá)Re（雷諾準(zhǔn)數(shù)）>104時(shí)，處于穩(wěn)定的湍流狀態(tài)；pH為7.5～9.0；濃縮倍數(shù)為3～5倍。對濃縮液再進(jìn)行冷丙酮沉淀，與前述方法雷同。得精品SOD的總酶活力為3000u/mg（鄰苯三酚法測定）。膜組體中PVC材質(zhì)φ65um×250um過濾精度為1um、0.1um微濾膜；截留分子量為1.6601×10-23kg、1.32808×10-22kg；截留率>90%（聚乙二醇-10000-80000）的SPES超濾膜。3酶抑制試驗(yàn)cmp-lkcn以Cu·Zn-SOD為主：分子量為3.