DB1408T048-2023蘋果脫毒組培苗繁育技術(shù)規(guī)程

ICS 65.020.20DB1408B05DB1408山 西 省 運 城 市 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB1408/T045—2023蘋果脫毒組培苗繁育技術(shù)規(guī)程2023-07-15發(fā)布2023-07-15發(fā)布2023-10-15實施運城市市場監(jiān)督管理局發(fā) 布DB1408/T045—2023目 次前言 II范圍 1規(guī)范性引用文件 1術(shù)語和定義 1脫毒 1葉原基 1莖尖 1莖尖分生組織 1離體培養(yǎng) 1外植體 2無菌苗 2脫毒材料的選取 2植株初選 2材料選擇 2脫毒與培養(yǎng) 2外植體消毒 2離體培養(yǎng)無菌苗 2莖尖剝離與接種 3莖尖培養(yǎng) 3病毒檢測 3組培苗擴繁 3培養(yǎng)基制備 3滅菌 3擴繁 4瓶苗培養(yǎng) 4生根培養(yǎng) 4DB1408/T045—2023前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由運城市果業(yè)發(fā)展中心提出、組織實施和監(jiān)督檢查。運城市市場監(jiān)督管理局對標(biāo)準(zhǔn)的組織實施情況進行監(jiān)督檢查。本文件由運城市果業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。本文件主要起草人：張健、王璐、潘琪、梁哲軍、袁嘉瑋、田時敏、李花、孫建春、景香平、暢元生。IIIIDB1408/T045—2023蘋果脫毒組培苗繁育技術(shù)規(guī)程范圍本文件規(guī)定了脫毒材料的選取、脫毒與培養(yǎng)、病毒檢測及組培苗擴繁等技術(shù)要求。本文件適用于蘋果苗木的脫毒和脫毒苗的組培快繁。規(guī)范性引用文件（包括所有的修改單適用于本文件。NY/T2281 蘋果病毒檢測技術(shù)規(guī)范術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1脫毒應(yīng)用莖尖分生組織培養(yǎng)技術(shù)，脫去潛隱性病毒，種類包括：蘋果莖溝病毒（ASGV）、蘋果莖痘病毒(ASPV)和蘋果褪綠葉斑病毒(ACLSV)。3.2葉原基在莖尖生長點的基部形成的突起。3.3莖尖芽頂端部分（0.1mm～1.0mm），包括分生組織及芽原基和正在生長發(fā)育的葉原基。3.4莖尖分生組織莖部位具有持續(xù)或周期性分裂能力的細(xì)胞群。3.5離體培養(yǎng)1DB1408/T047—20233.6外植體從生長健壯、無病蟲害的植株上取下作離體培養(yǎng)材料的器官或組織的片段。3.7無菌苗在無菌條件下，將蘋果枝條莖段按照外植體消毒流程進行嚴(yán)格消毒后，接種在MS培養(yǎng)基上，在人工控制條件下培養(yǎng)獲得無菌完整植株。脫毒材料的選取植株初選蘋果生育期內(nèi)，于現(xiàn)蕾至開花期選擇生長勢強、具有該品種典型性狀的健壯植株，做好標(biāo)記。材料選擇在初選植株中，選取帶2～3個腋芽的嫩莖。脫毒與培養(yǎng)外植體消毒外植體消毒取材待春梢生長到10cm～20cm時，在連續(xù)5個以上晴天的上午在大田中剪取帶2～3個腋芽的嫩莖，剪取前做好工具消毒。清洗將外植體置于稀釋200倍的洗潔精溶液中浸泡15min，并用清水沖洗干凈。消毒5%酒精中30s.1%gl5n；再用無菌水沖洗5～7次，并用無菌濾紙吸干表面水分。離體培養(yǎng)無菌苗接種1cm部分，接種在MS培養(yǎng)基上。培養(yǎng)方法2DB1408/T045—2023在培養(yǎng)容器上注明品種名稱和接種時間，放入培養(yǎng)間培養(yǎng)21d～25d，待其膨大基部分化出5～7個新梢，切成單獨小苗，轉(zhuǎn)接于同樣的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)成苗。同樣方法擴繁2個周期，待苗達(dá)到一定數(shù)量后，從無菌苗上剝離莖尖。5.2.3培養(yǎng)條件溫度（26±2）℃，采用人工光源，光照強度2000Lux～3000Lux，光照時數(shù)12h/d。莖尖剝離與接種置于濾紙上。在40X雙目解剖鏡下，剝離莖尖直至露出半圓形光滑生長點。用無菌解剖針切取0.25mm帶1～2個葉原基的莖尖，立即接種于MS培養(yǎng)基上，每瓶培養(yǎng)基接種1個莖尖。接種后封口，暗培養(yǎng)20d轉(zhuǎn)光照培養(yǎng)，在容器上注明編號、品種名稱、接種時間。莖尖培養(yǎng)暗培養(yǎng)接種好的莖尖放入培養(yǎng)間進行暗培養(yǎng)，溫度（26±2）℃。光培養(yǎng)暗培養(yǎng)20d后選取變大轉(zhuǎn)綠的莖尖進行光培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同5.2.3。5.4.3 成苗5.4.3 成苗培養(yǎng)30d選擇莖尖分化出帶有2～3片葉的嫩梢，轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基，培養(yǎng)成苗6 病毒檢測病毒檢測方法執(zhí)行NY/T2281的規(guī)定，通過檢測確認(rèn)是否脫除了本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的所檢病毒，篩選出不帶有病毒的植株。7 組培苗擴繁培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基配制選擇用MS培養(yǎng)基，根據(jù)培養(yǎng)品種不同添加吲哚乙酸0.1mg/L～0.3mg/L，6-芐基嘌呤0.4mg/L～0.8mg/L。培養(yǎng)基分裝選擇250ml培養(yǎng)瓶，將配制好的培養(yǎng)基裝入培養(yǎng)瓶中，每瓶加入50ml的培養(yǎng)基，用帶透氣膜的蓋子封口。7.2 滅菌3DB1408/T047—2023培養(yǎng)基滅菌1.1kg/cm2121℃條件下滅菌25d～7d待用。接種器具滅菌將鑷子、手術(shù)刀、解剖針、培養(yǎng)皿和濾紙分別用紗布包裹好置于高壓蒸汽滅菌鍋，在壓力為1.1kg/cm2、溫度為121℃條件下滅菌30min，取出后置于60℃烘箱中烘干備用。擴繁擴繁程序7510注意事項每個操作人員配兩套接種工具，交替滅菌使用。每接種完一瓶母瓶后，將鑷子、手術(shù)刀在75%酒精中浸蘸后插入工具消毒器中消毒。瓶苗培養(yǎng)瓶苗培養(yǎng)培養(yǎng)條件接種好的瓶苗放入培養(yǎng)間，培養(yǎng)條件同5.2.3。繼代培養(yǎng)脫毒苗（30±2）d繼代繁殖一次，待組培苗長到2cm可再次繼代擴繁或轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)。生根培養(yǎng)生根培養(yǎng)在超凈工作臺上向裝有350g蛭石的培養(yǎng)盒子（25cm×20cm×5cm）內(nèi)加入500mL的?MS溶液。選取苗高2cm以上的脫毒苗，