r-藻紅蛋白標(biāo)記的遺傳標(biāo)記與抗魚(yú)抗小清蛋白的鑒定

r-藻紅蛋白標(biāo)記的遺傳標(biāo)記與抗魚(yú)抗小清蛋白的鑒定

熒光免疫分析是一種用熒光標(biāo)記物作為標(biāo)記免疫分析的疾病。它具有很高的靈敏度，可以定量或定位地檢測(cè)抗或抗。但是,傳統(tǒng)的熒光素(如FITC等)由于非特異熒光干擾,存在檢測(cè)特異性低等問(wèn)題。R-藻紅蛋白(R-phycoerythrin,R-PE)主要存在于紅藻和部分藍(lán)藻中,是應(yīng)用較廣的一種色素蛋白。R-PE由脫輔基寡聚蛋白與開(kāi)鏈四吡咯發(fā)色團(tuán)共價(jià)結(jié)合而成。組成寡聚蛋白的亞基有α、β、γ3種。通常,紅藻中的R-PE以(αβ)6γ形式存在,分子量約為240ku,極少種類的R-PE有不同亞基數(shù)目。R-PE色澤鮮艷,并具有抗癌、抗氧化等功效,可作為天然色素應(yīng)用。由于色素分子的存在,R-PE在可見(jiàn)光區(qū)480～570nm波段有較強(qiáng)的吸收,且可產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光。R-PE具有熒光強(qiáng)度大,量子產(chǎn)率高的特點(diǎn),易與生物素、單克隆抗體等蛋白質(zhì)結(jié)合,是一種良好的熒光標(biāo)記物,被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷和生物學(xué)等研究領(lǐng)域。探索簡(jiǎn)易、可靠的分離純化技術(shù)和蛋白交聯(lián)技術(shù)是藻紅蛋白熒光探針研制和應(yīng)用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。本文在前期研究的基礎(chǔ)上,對(duì)紅毛藻R-PE的分離純化進(jìn)行了優(yōu)化,并將高純度R-PE與羊抗小鼠IgG進(jìn)行偶聯(lián),制備熒光探針并應(yīng)用于魚(yú)類主要過(guò)敏原小清蛋白的檢測(cè),以期為今后開(kāi)發(fā)高靈敏度免疫熒光診斷試劑用于食品安全檢測(cè)提供參考。1材料和方法1.1其它試劑和儀器紅毛藻(Bangiafusco-purpurea)干品福建省莆田市南日島養(yǎng)殖產(chǎn)品;DEAE-Sepharose、硝酸纖維素膜GEHealthcare公司;小鼠抗鰱魚(yú)小清蛋白單克隆抗體本研究室制備;SDS標(biāo)準(zhǔn)蛋白Fermentas公司;N-琥珀酰亞胺-3-2-吡啶基二硫丙酸酯(SPDP)、2-亞氨基四氫噻吩(2-IT)Thermo公司;羊抗小鼠IgG廈門(mén)波生生物技術(shù)有限公司;其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。PT-2100型組織搗碎機(jī)瑞士Kinematica公司;AvantiJA-25型高速冷凍離心機(jī)美國(guó)Beckman公司;BiologicLP型蛋白質(zhì)柱層析系統(tǒng)美國(guó)Bio-Rad公司;G:BOX型凝膠成像儀英國(guó)Syngene公司;BioPhotometer型紫外分光光度計(jì)德國(guó)Eppendorf公司;pH計(jì)美國(guó)Beckman公司;Fluorchem型熒光化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀法國(guó)AlphaInnotech公司;WB-14型恒溫水浴德國(guó)Memmert公司。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1藻紅蛋白的提取、分離、提取取10g干燥的紅毛藻碾成粉末后,浸泡于200mL蒸餾水中,在-70℃和常溫下反復(fù)凍融三次。凍融液用磁力攪拌器攪拌2h,用蒸餾水稀釋至400mL,經(jīng)組織搗碎機(jī)搗碎、超聲波破碎、絹布過(guò)濾、離心20min(15000×g,4℃)后棄沉淀,所得的上清液即為藻膽蛋白粗提液。將粗提液進(jìn)行35%～50%飽和度的硫酸銨沉淀,離心20min后棄上清。將沉淀溶解于少量的0.02mol/L磷酸緩沖液(PBS,pH7.0)中,即為藻紅蛋白粗提液。用0.02mol/LPBS(pH5.6,含0.05mol/LNaCl)平衡DEAE-Sepharose柱(2.5cm×10cm),將用初始緩沖液透析過(guò)的藻紅蛋白粗提液上樣于該柱。充分洗凈未吸附蛋白后,在弱光條件下,使用相同體積的0.02mol/LPBS(pH5.6,含0.05mol/LNaCl)和0.2mol/LNaH2PO4(pH4.1,含0.2mol/LNaCl)作線性梯度洗脫,洗脫液總體積為500mL,流速為1mL/min。收集洗脫組分,每管收集3mL,測(cè)其A565、A620、A650、A280。根據(jù)各組分的特征吸收值及色譜帶的顏色,選取純度較高,即A565/A280>5.0的組分避光保存于4℃冰箱中備用。1.2.2e和熒光檢測(cè)參照Laemmli法,使用15%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)和熒光檢測(cè)來(lái)分析R-藻紅蛋白的分子量及純化效果,以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)(116.0～14.4ku)作對(duì)照。電泳結(jié)束后,采用化學(xué)發(fā)光熒光和可見(jiàn)光在534nm的激發(fā)光源下對(duì)凝膠進(jìn)行熒光成像,并使用考馬斯亮藍(lán)R-250對(duì)蛋白進(jìn)行染色。1.2.3熒光標(biāo)記抗體的制備采用異型雙功能交聯(lián)劑SPDP和2-IT(2-亞氨基四氫噻吩)來(lái)實(shí)現(xiàn)R-藻紅蛋白與羊抗小鼠IgG(二抗)的偶聯(lián)。SPDP在R-藻紅蛋白上衍生吡啶二硫基團(tuán),生成R-藻紅蛋白的SPDP衍生物;羊抗小鼠IgG經(jīng)2-IT活化后引入游離的外源性-SH基團(tuán),將攜帶吡啶二硫鍵的R-藻紅蛋白與攜帶-SH的羊抗小鼠IgG按一定摩爾比交聯(lián),制備熒光標(biāo)記抗體。具體步驟參考Thermo公司說(shuō)明書(shū)和文獻(xiàn),并略做修改。R-藻紅蛋白在使用前需用0.02mol/L的PBS(pH7.5)進(jìn)行脫鹽,之后向R-藻紅蛋白和羊抗小鼠IgG中分別加入適量濃度的SPDP溶液和2-IT溶液,混合均勻后在室溫下避光振蕩反應(yīng)2h,超濾離心除去游離的SPDP和2-IT。調(diào)整衍生化的R-藻紅蛋白與巰基化的羊抗小鼠IgG的摩爾比,混勻后在室溫下避光振蕩反應(yīng)18h,完成交聯(lián)反應(yīng)。1.2.4ds-東南角分布R-藻紅蛋白與抗體標(biāo)記完成后,上樣于15%SDS。電泳結(jié)束后,采用化學(xué)發(fā)光熒光和可見(jiàn)光在534nm的激發(fā)光源下對(duì)凝膠進(jìn)行熒光成像,并使用考馬斯亮藍(lán)R-250染色分析偶聯(lián)結(jié)果。1.2.5小鼠抗材料免疫印跡檢測(cè)R-藻紅蛋白標(biāo)記羊抗小鼠IgG的免疫檢測(cè)通過(guò)免疫印跡(Westernblot)和點(diǎn)雜交(Dotblot)實(shí)現(xiàn)。Westernblot參照Towbin法進(jìn)行,以牛血清白蛋白為對(duì)照,即鯽魚(yú)小清蛋白(過(guò)敏原)和牛血清白蛋白經(jīng)SDS后,轉(zhuǎn)膜,以5%的脫脂奶封閉后,采用小鼠抗鰱魚(yú)小清蛋白單克隆抗體1∶1000稀釋為一抗,R-藻紅蛋白標(biāo)記的羊抗小鼠IgG1∶200稀釋為二抗進(jìn)行免疫印跡反應(yīng),分析檢測(cè)結(jié)果。Dotblot方法如下:將鯽魚(yú)小清蛋白稀釋至濃度為0.3、0.1、0.03、0.01mg/mL后,從左至右依次點(diǎn)樣1.2μL于NC膜上,以5%的脫脂奶封閉后,采用小鼠抗鰱魚(yú)小清蛋白單克隆抗體(1∶1000稀釋)為一抗,R-藻紅蛋白標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(1∶400稀釋)為二抗進(jìn)行點(diǎn)雜交,分析檢測(cè)結(jié)果。2結(jié)果與討論2.1反應(yīng)物deea-地震波層析紅毛藻R-藻紅蛋白粗提液透析后上樣于DEAE-Sepharose陰離子交換柱,經(jīng)過(guò)0.05～0.2mol/LNaCl線性梯度和pH4.1～5.6線性梯度相結(jié)合洗脫后,在R-藻紅蛋白的最大特征吸收峰對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)565nm下,可檢測(cè)到一個(gè)較高的蛋白峰(圖1)。R-藻紅蛋白純度以該溶液在R-藻紅蛋白最大可見(jiàn)吸收峰對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)下的吸光值與蛋白質(zhì)的特征吸光值之比(A565/A280)來(lái)表示。經(jīng)DEAE-Sepharose陰離子交換柱層析,R-藻紅蛋白純度系數(shù)達(dá)到6.25,而A620/A280和A650/A280均小于0.01,說(shuō)明溶液中不存在其它的藻藍(lán)蛋白和別藻藍(lán)蛋白,同時(shí)測(cè)得A620/A565<0.02,即達(dá)到R-藻紅蛋白作為熒光標(biāo)記物的要求。前期的報(bào)道顯示,R-藻紅蛋白需采用兩次或更多次的柱層析才達(dá)到較好的純化效果,如Sun等用SepharoseCL-4B、SephadexG-200和DEAESepharoseFastFlow三次柱層析從海藻(macroalgaHeterosiphoniajaponica)中得到純度為4.89的R-藻紅蛋白。Rossano等采用hydroxyapatitecolumn以及Superdex75柱層析從地中海紅藻(Corallinaelongata)中純化出純度大于5.3的R-藻紅蛋白。本研究?jī)H采用DEAESepharose一次柱層析,能分離純化得到純度為6.25的R-藻紅蛋白,步驟更少,方法和操作簡(jiǎn)單快速,且重復(fù)性好,并且獲得的R-藻紅蛋白純度也高于Liu等采用DEAESepharoseFastFlow一次柱層析從Polysiphoniaurceolatak中得到的R-藻紅蛋白(純度系數(shù)為5.6)。2.2亞基分子量和亞基SDS結(jié)果顯示,純化得到的R-藻紅蛋白的α亞基和β亞基的相對(duì)分子質(zhì)量分別約為19、21ku(圖2A),因兩者的相對(duì)分子質(zhì)量接近,所以出現(xiàn)了部分重疊現(xiàn)象,這與文獻(xiàn)報(bào)道的R-藻紅蛋白的亞基分子量大小相近,而γ亞基由于含量太少而未能檢測(cè)出一致。藻紅蛋白的熒光檢測(cè)結(jié)果如圖2B所示,在藻紅蛋白的α和β亞基的位置出現(xiàn)相應(yīng)的明亮熒光條帶,而γ亞基由于含量少,故在相應(yīng)的位置沒(méi)有觀察到熒光條帶,說(shuō)明純化的R-藻紅蛋白熒光較強(qiáng)。2.3熒光檢測(cè)結(jié)果R-藻紅蛋白與羊抗小鼠IgG分別經(jīng)異型雙功能交聯(lián)劑SPDP和2-IT作用后進(jìn)行交聯(lián),結(jié)果如圖3所示。SDS(圖3A)顯示,在分離膠頂部出現(xiàn)大分子量的聚合物,推測(cè)該聚合物可能是R-藻紅蛋白與羊抗小鼠IgG交聯(lián)后的生成物。對(duì)蛋白進(jìn)行熒光檢測(cè)結(jié)果如圖3B所示,除R-藻紅蛋白的熒光條帶外,在分離膠的頂部也有熒光亮帶出現(xiàn),與SDS中大分子量聚合物的位置一致。由于羊抗小鼠IgG不會(huì)產(chǎn)生熒光,說(shuō)明R-藻紅蛋白與羊抗小鼠IgG已經(jīng)成功交聯(lián)。分離膠頂部的大分子量聚合物即為R-藻紅蛋白與羊抗小鼠IgG的交聯(lián)物,且熒光強(qiáng)度較高。R-藻紅蛋白標(biāo)記抗體的鑒定一般是采用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)交聯(lián)物的熒光發(fā)射光譜。顏世敢等采用SDS對(duì)R-藻紅蛋白標(biāo)記的抗雞IgG進(jìn)行了檢測(cè),但未對(duì)其進(jìn)行熒光檢測(cè)。本文采用的SDS結(jié)合熒光檢測(cè)方法可直接通過(guò)觀察蛋白及相應(yīng)的熒光條帶鑒定R-藻紅蛋白與抗體是否成功偶聯(lián),較光譜掃描等方法更加直觀和快捷。2.4r-海藻蛋白熒光雜交物質(zhì)的免疫檢測(cè)2.4.1反應(yīng)物系-熒光定量條件檢測(cè)用小鼠抗鰱魚(yú)小清蛋白單克隆抗體(一抗),R-藻紅蛋白標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(二抗)對(duì)鯽魚(yú)小清蛋白進(jìn)行免疫反應(yīng)的Westernblot結(jié)果如圖4所示。在分子量為10ku處有一個(gè)明亮的特異性反應(yīng)條帶,說(shuō)明R-藻紅蛋白標(biāo)記的羊抗小鼠IgG能間接快速地檢測(cè)過(guò)敏原(鯽魚(yú)小清蛋白)的存在。通過(guò)觀察熒光強(qiáng)度和位置,即可直觀快速地確定過(guò)敏原的存在,提高了檢測(cè)速度和靈敏度。此外,該抗體與牛血清白蛋白不產(chǎn)生反應(yīng),說(shuō)明其具有良好的特異性。2.4.2抗hp-pcr和sds-東南角檢測(cè)將不同濃度的鯽魚(yú)小清蛋白與小鼠抗鰱魚(yú)小清蛋白單克隆抗體反應(yīng)后,用R-藻紅蛋白標(biāo)記的羊抗小鼠IgG進(jìn)行免疫反應(yīng)。結(jié)果如圖5所示,從圖中熒光亮度可知,當(dāng)鯽魚(yú)小清蛋白濃度為0.03mg/mL時(shí)仍能被檢測(cè)到,說(shuō)明R-藻紅蛋白標(biāo)記的羊抗小鼠IgG有較高的靈敏度,能較好地應(yīng)用于免疫檢測(cè)領(lǐng)域。小清蛋白是魚(yú)類的主要過(guò)敏原,痕量的過(guò)敏原即可能導(dǎo)致過(guò)敏患者產(chǎn)生嚴(yán)重的過(guò)敏反應(yīng)。目前對(duì)魚(yú)類過(guò)敏原的分析主要采用ELISA、PCR、SDS等方法進(jìn)行檢測(cè),如Faste等采用抗鱈魚(yú)小清蛋白多克隆抗體建立了雙抗夾心ELISA檢測(cè)食物中小清蛋白的存在情況,但操作復(fù)雜且費(fèi)時(shí)費(fèi)力。Sun等采用RT-PCR對(duì)小清蛋白進(jìn)行了檢測(cè),但該法不能從蛋白水平如實(shí)反應(yīng)食品中過(guò)敏原的存在情況。而本研究采用R-藻紅蛋白標(biāo)記二次抗體的Westernblot和Dotblot檢測(cè)方法,操作簡(jiǎn)單,直接通過(guò)觀察熒光強(qiáng)度和位置即可確定過(guò)敏原(小清蛋白)的存在,能如實(shí)反映水產(chǎn)食品中過(guò)敏原的存在情況,提高了檢測(cè)速度。3r-藻紅