酵母雙雜交系統(tǒng)的功能和蛋白質(zhì)組學(xué)研究進展

酵母雙雜交系統(tǒng)的功能和蛋白質(zhì)組學(xué)研究進展

隨著人類工作組計劃的加快，人們對收到天地間書籍并不滿意。解讀天地間和解碼生活是當務(wù)之急。為適應(yīng)同時對多個基因或蛋白進行研究的需要,DNA芯片技術(shù)、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)、蛋白雙向凝膠電泳、基因表達系列分析、肽質(zhì)譜分析等新技術(shù)不斷涌現(xiàn),其中酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用日益廣泛。1酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用價值酵母雙雜交系統(tǒng)自1989年建立以來,短短12年的時間,其應(yīng)用十分廣泛,成果也十分豐富,尤其在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究中具有重要的應(yīng)用價值。在細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中,物質(zhì)與物質(zhì)的相互作用是一種主要的信號傳遞形式。專門研究物質(zhì)間(蛋白與蛋白、蛋白與核酸、蛋白與小分子配體等)相互作用的酵母雙雜交系統(tǒng)正好符合信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究需要,對細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究起重要的促進作用。但在實際應(yīng)用過程中,傳統(tǒng)的酵母雙雜交系統(tǒng)有不少的局限性,人們根據(jù)不同的需要對傳統(tǒng)的酵母雙雜交系統(tǒng)進行了改造,發(fā)展了多種新的技術(shù)。1.1蛋白質(zhì)與蛋白相互作用蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)除了直接相互作用外,在許多細胞內(nèi)的信號傳遞過程中往往需要另外的分子參與,包括聯(lián)結(jié)蛋白、多肽、激酶、RNA和一些小分子有機配體。這第三個分子可通過穩(wěn)定誘餌蛋白與靶蛋白的相互作用,或作為橋梁介導(dǎo)兩者的相互作用,或修飾其一后,引起兩者的相互作用。這第三個分子可稱為adaptor,目前研究較多的是蛋白質(zhì)adaptor,如Grb2、Raf等在信號傳遞過程中都起重要的聯(lián)結(jié)作用。傳統(tǒng)的雙雜交系統(tǒng)研究蛋白與蛋白的相互作用,小分子配體三雜交系統(tǒng)(smallligandthree-hybridsytem)開辟對非蛋白質(zhì)的小分子有機配體的研究。如免疫抑制劑FK506與地塞米松的有機合成雜交分子,作為誘餌蛋白(糖皮質(zhì)激素受體與BD的融合蛋白)的配體,從與轉(zhuǎn)錄激活域融合在一起的靶蛋白cDNA文庫中,成功地篩選出了FKBP12蛋白,表明這種方法能鑒定非蛋白或多肽的小分子物質(zhì)與蛋白質(zhì)大分子的相互作用。以RNA介導(dǎo)蛋白與蛋白相互作用的RNA三雜交系統(tǒng)(RNAthree-hybridsystem)能夠鑒定蛋白質(zhì)與RNA的相互作用。從而通過已知靶RNA系統(tǒng)鑒定新的RNA結(jié)合蛋白,或通過已知蛋白篩選與之特異結(jié)合的RNA。1.2單雜交系統(tǒng)研究許多細胞信號最終要導(dǎo)入核內(nèi),引起相關(guān)基因的表達改變,這就需要研究蛋白與DNA的相互作用。在此,單雜交系統(tǒng)是一項有效的技術(shù)。它是將要研究的DNA序列置于報告基因的上游,以這段特異性的DNA序列作為誘餌,去篩選cDNA文庫編碼的靶蛋白。單雜交系統(tǒng)將在基因調(diào)控等功能研究中發(fā)揮積極的作用。1.3分離雙雜交系系統(tǒng)在確定了蛋白質(zhì)之間的相互作用后,進一步研究其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系及其調(diào)節(jié)顯得十分必要。這不僅有利于鑒定那些阻礙蛋白相互作用的突變結(jié)構(gòu)或突變單位,對篩選特異性蛋白相互作用的阻斷劑也是十分有效的,必將增加人們對細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的人為控制能力。1996年,Vidal等建立了反向雙雜交系統(tǒng),按照反選擇策略,一類方法是設(shè)計一種能直接或間接地導(dǎo)致細胞毒性或死亡的報告基因,正常的蛋白相互作用后引發(fā)細胞死亡,而蛋白與蛋白結(jié)合區(qū)的突變或其他外界因素若干預(yù)蛋白間的相互作用時,報告基因就不表達,細胞得以存活,按此類設(shè)計,Vidal等引入URA3基因作為報告基因,該基因編碼的酶能將培養(yǎng)基中加入的5-氟乳清酸轉(zhuǎn)變?yōu)?-氟脲苷,5-氟脲苷進一步變?yōu)?-氟脫氧脲苷,它競爭性地抑制胸苷的合成,從而阻礙DNA合成,引起細胞死亡。在含α-氨基乙酸鹽的培養(yǎng)基中LYS2報告基因的表達以及Gallo酵母在含半乳糖的培養(yǎng)基中GAL1基因的表達,均能產(chǎn)生細胞毒性物殺死酵母細胞。另一類方法則是將營養(yǎng)性報告基因(如HIS3)置于tet操縱子之下,若有蛋白相互作用,就表達抑制因子TetR,TetR結(jié)合到tet操縱子上后抑制報告基因的表達,在營養(yǎng)缺陷的選擇性培養(yǎng)基上,細胞不能存活,只有蛋白的相互作用被阻斷后,轉(zhuǎn)化子才能生長。該系統(tǒng)又稱分裂雙雜交系統(tǒng)(split-two-hybridsystem)。反向雙雜交系統(tǒng)在研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能,生物學(xué)制劑的篩選中發(fā)揮著越來越重要的作用。1.4原代地質(zhì)系統(tǒng)前面所述的酵母雜交系統(tǒng)均是建立在對RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ激活的基礎(chǔ)上,整個過程在細胞核內(nèi)完成。然而許多蛋白要到膜上或胞漿內(nèi)才表現(xiàn)正常的生物學(xué)功能;另外,大多數(shù)真核細胞蛋白翻譯后要經(jīng)過加工與修飾,才與其他蛋白質(zhì)起作用,因此核外雙雜交系統(tǒng)應(yīng)運而生(見圖1)。1997年,Aronheim等建立的Sos復(fù)原系統(tǒng)(Sosrecruitmentsystem,SRS)就是一個典型的代表。該系統(tǒng)中蛋白的相互作用發(fā)生在膜上,它通過待測蛋白的相互作用,將Sos蛋白帶到細胞膜上,激活附近的Ras蛋白,從而打通Ras信號途徑,使Ras途徑不通的菌株得以生存?；诒樵诘鞍椎姆至训鞍讉鞲衅?Ubiquitin-basedSplitProteinSensor,USPS)系統(tǒng)中蛋白的相互作用則發(fā)生在胞漿內(nèi)。遍在蛋白(ubiquitin)的N端與C端分別與待測蛋白X與Y融合,借助待測蛋白X與Y的相互作用,重新聯(lián)系在一起形成正確的折疊,引來遍在蛋白酶水解掉遍在蛋白C端下游接上的報告蛋白,如二氫葉酸還原酶,進一步通過Westernblot檢測是否有切下來的報告蛋白,以反映蛋白間的相互作用。如果遍在蛋白C端下游不接報告蛋白,而接一融合的轉(zhuǎn)錄激活因子如蛋白A、LexA與VP16的融合蛋白(proteinA-LexA-VP16,PLV),通過對報告基因表型的觀察,篩選的步驟則可大大地簡化。1.5其他改進1.5.1減少假陽性傳統(tǒng)的酵母雙雜交系統(tǒng)假陽性通?？蛇_10%～90%不等,采用2～3個報告基因可以減少假陽性,如Clontech公司的MATCHMAKERSystem3,由于采用了三個報告基因ADE2,HIS3與LacZ,最后在ADE與HIS缺乏的選擇性培養(yǎng)基中,生成的藍色菌落幾乎全為真陽性。1.5.2可以降低數(shù)據(jù)庫的毒性酵母細胞的轉(zhuǎn)化效率比大腸桿菌低4個數(shù)量級,標準的雙雜交實驗要經(jīng)過兩次轉(zhuǎn)化,不但工作量大,而且轉(zhuǎn)化效率低,成了制約該系統(tǒng)應(yīng)用的瓶頸。采用共轉(zhuǎn)化后不但省時省力,還可減弱或消除單獨轉(zhuǎn)化時表達的融合蛋白對宿主細胞的毒性。Bendixen等人利用單倍體酵母細胞具有有性生殖的特點,將靶蛋白載體與誘餌蛋白載體分別轉(zhuǎn)化入a型和α型酵母菌中,然后利用三重篩選平板,篩選α型與a型交合的二倍體酵母,從而將兩種載體導(dǎo)入一個細胞,大大提高了轉(zhuǎn)化效率。1.5.3轉(zhuǎn)錄激活活性由于轉(zhuǎn)錄因子具組件式特點,我們可以根據(jù)需要,選擇不同來源的轉(zhuǎn)錄激活域去構(gòu)建靶蛋白表達載體。按轉(zhuǎn)錄激活活性的大小排列,VP16較Ga14regionⅡ大,Ga14regionⅡ又較B42強。由于存在毒性問題,并非轉(zhuǎn)錄活性越大越好。其中B42能消除強轉(zhuǎn)錄活化子對酵母細胞的毒性,從而提高對靶蛋白的篩選范圍。1.5.4檢測靈敏度和靈敏度Clontech公司最新開發(fā)的MATCHMAKERBioSensorKit運用時間分辯熒光法檢測比標準熒光法的靈敏度提高4倍,同時96孔板的配對分析模式,使檢測只需30個小時,尤其適用于可阻斷蛋白相互作用的藥物篩選。2酵母雙雜交系統(tǒng)的改良盡管酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用十分廣泛,但其內(nèi)在局限性,如表達的靶蛋白與誘餌蛋白有些不可溶,有些無核定位,蛋白翻譯后的修飾不適當,可能不正確的折疊及酵母細胞內(nèi)特定因素引起的假陽性與假陰性等問題,在酵母細胞內(nèi)是很難解決的。將雙雜交系統(tǒng)移植到大腸桿菌或哺乳動物細胞中,是發(fā)展的兩種趨勢。1998年,KarimovaG等人將待測蛋白X與Y,分別與來自百日咳博德特氏菌的腺苷酸環(huán)化酶的T25與T18片段融合轉(zhuǎn)入大腸桿菌。當X與Y有相互作用時,T25與T18重新組合,腺苷酸環(huán)化酶的活性重新恢復(fù),水解ATP為cAMP,cAMP與CAP形成復(fù)合物引起相應(yīng)報告基因的表達。此系統(tǒng)的融合蛋白無須核定位,更重要的是大腸桿菌的高轉(zhuǎn)化率有利于對文庫的全面分析。哺乳動物細胞的雙雜交系統(tǒng)能更真實地反映待測蛋白間的相互作用,并且能夠?qū)崟r觀察或鑒定外界處理因素對這種相互作用的影響。但該系統(tǒng)在廣泛應(yīng)用之前,還必須進一步完善并簡化。酵母雙雜交系統(tǒng)因其內(nèi)在的不足之處,雙雜交結(jié)果只是反映發(fā)生在酵母細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白與核酸、蛋白與小分子配體等分子間發(fā)生相互作用的可能性。這種可能還必須經(jīng)過其它實驗加以驗證,否則可能會得出錯誤的結(jié)果。雖然如此,但在沒有更好的方法問世之前,酵母雙雜交系統(tǒng)仍以其能直接鑒定蛋白與蛋白、蛋白與DNA、蛋白與RNA的相互作用,無需制備抗體,無需蛋白純化,活體內(nèi)實驗比體外實驗更接近實際情況,比其它生物化學(xué)方法更靈敏,檢測范圍更寬等優(yōu)勢,在研究體內(nèi)大分子物質(zhì)間相互作用的研究中,尤其對細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究發(fā)揮極其重要的作用。細胞的信號傳遞離不開蛋白與蛋白的相互作用,如果我們以某一信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑為出發(fā)點,通過雙雜交實驗就可以建立起酵母細胞內(nèi)的完整的蛋白質(zhì)聯(lián)系圖譜。Ito等的工作為全面認識酵母細胞內(nèi)蛋白質(zhì)間