蛋白質(zhì)組學(xué)的相關(guān)技術(shù)及應(yīng)用

蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)

的相關(guān)技術(shù)及應(yīng)用蔡燦陳蕾陳磊磊李振蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)的含義蛋白質(zhì)組學(xué)種類蛋白質(zhì)組學(xué)研究的相關(guān)技術(shù)蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)路線蛋白質(zhì)組學(xué)的含義蛋白質(zhì)組(Proteome):最早由澳大利亞學(xué)者Wikins等于1994年提出,指的是由一個基因組或一個細(xì)胞、組織表達的所有protein。蛋白質(zhì)組是一個動態(tài)的概念。蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics):則是研究特定時間或特定條件下這些蛋白質(zhì)表達情況的科學(xué)，其內(nèi)容包括蛋白質(zhì)的定性鑒定、定量檢測、細(xì)胞內(nèi)定位、相互作用研究等。其目的在于歸類細(xì)胞中的蛋白質(zhì)的整體分布，鑒定并分析感興趣的個別蛋白，最終闡明它們的關(guān)系與功能。是基因組ＤＮＡ序列與基因功能之間的橋梁。蛋白質(zhì)組學(xué)與基因組學(xué)基因組(genome):指細(xì)胞或生物體的一套完整的單倍體遺傳物質(zhì)，是所有不同染色體上全部基因和基因間的DNA的總和?；蚪M是一個相對靜態(tài)的概念。基因組學(xué)(genomics)

:是研究生物基因組的組成，組內(nèi)各基因的精確結(jié)構(gòu)、相互關(guān)系及表達調(diào)控的科學(xué)。利用遺傳圖、物理圖、全序列圖可以精確定位基因內(nèi)部序列結(jié)構(gòu)與所有基因間隔序列。蛋白質(zhì)組學(xué)種類

表達蛋白質(zhì)組學(xué)：其目標(biāo)是研究細(xì)胞或組織在不同條件，如藥物或疾病狀態(tài)下蛋白質(zhì)的表達和功能，這將有助于識別疾病特異蛋白、藥物作用靶點、藥物功效和毒性標(biāo)記等，其運用技術(shù)主要依賴雙相凝膠電泳技術(shù)以及圖像分析系統(tǒng),當(dāng)對感興趣的蛋白質(zhì)進行分析時可能用到質(zhì)譜。結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)：其目標(biāo)是識別蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)并研究蛋白質(zhì)間的相互作用。蛋白質(zhì)之間的相互作用與控制細(xì)胞生長、復(fù)制等的代謝和信號通路有關(guān)，蛋白質(zhì)之間相互作用的改變可能引起人類疾病，因此蛋白質(zhì)之間的相互作用在識別新的藥物干預(yù)靶點方面有很大的潛力。蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)路線蛋白質(zhì)組流程圖蛋白質(zhì)組學(xué)研究的相關(guān)技術(shù)雙向電泳技術(shù)質(zhì)譜蛋白質(zhì)組中生物信息學(xué)雙向電泳技術(shù)雙向電泳(TwoDimensionalElectrophoresis，2DE)是蛋白質(zhì)組研究的三大關(guān)鍵核心技術(shù)之一，由Farrel等人于1975年建立。它是利用蛋白質(zhì)的帶電性和分子量大小的差異，通過兩次凝膠電泳達到分離蛋白質(zhì)組的技術(shù)。雙向電泳技術(shù)能同時將上千種蛋白質(zhì)同時分離和展示,也是目前分析復(fù)雜組份蛋白質(zhì)分辨率最高的工具。1基本原理第一向：pH梯度等電聚焦,因為蛋白質(zhì)是兩性分子,具有不同的等電點,在pH梯度介質(zhì)中外加電場作用形成分離的蛋白質(zhì)區(qū)帶。IEF時，在電場的作用下，蛋白質(zhì)將移向其靜電荷為零的點，靜電荷為正的蛋白將移向負(fù)極，靜電荷為負(fù)的將移向正極，直到達到等電點，這就是IEF的聚焦效應(yīng)。第二向：根據(jù)分子量不同進行分離，此相是在包含SDS的聚丙烯酰胺凝膠中進行。SDS是一種陰離子去污劑，它能纏繞在多肽骨架上使蛋白質(zhì)帶負(fù)電，所帶電荷與蛋白質(zhì)的分子量成正比，在SDS聚丙烯酰胺凝膠中蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)與它在膠中移動的距離基本成線性關(guān)系。2DE基本原理圖示2雙向電泳的技術(shù)方法蛋白樣品制備等電聚焦IPG膠條平衡SDS染色2DE基本流程圖蛋白樣品制備

樣品制備主要包括溶解、變性、還原等步驟,以充分破壞蛋白質(zhì)之間的相互作用,并同時除去其中的非蛋白質(zhì)組分如核酸等。(1)細(xì)胞培養(yǎng)、處理和收集；(2)將細(xì)胞在IEF裂解緩沖液中溶解(3)將樣品離心以去除不溶的細(xì)胞碎片和DNA，提取上清，-80℃保存。樣品制備原則1.盡可能多地使細(xì)胞或組織中的蛋白溶解，包括多數(shù)疏水性蛋白（變性劑、表面活性劑、還原劑）2.防止樣品在聚焦時發(fā)生蛋白的聚集和沉淀3.完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白4.避免蛋白質(zhì)被修飾得到錯誤的關(guān)于其等電點的信息5.防止在樣品制備過程中發(fā)生樣品的抽提后化學(xué)修飾（如酶性或化學(xué)性降解等）6.為富集特定的蛋白,可以采用不同的樣品處理方法7.蛋白質(zhì)樣品與第一向電泳的相容性不同的樣品處理方法

組織細(xì)胞:低滲、勻漿、超聲、反復(fù)凍融等體液成分(如血清、腹水、尿液等):僅需經(jīng)過稀釋、加熱變性、溶解于適當(dāng)緩沖液便可用于雙向電泳植物組織:先采用冷丙酮及三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)，不僅有效抑制了蛋白酶對蛋白質(zhì)的水解作用，而且除去了色素、酚等干擾雙向電泳的物質(zhì)Dnase、RnaseA來降解核酸二次樣品制備雙向電泳的技術(shù)圖等點聚焦（IEF）

IEFE一種利用具有pH梯度的支持介質(zhì)分離等點電不同的蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。根據(jù)建立pH梯度原理不同分為：載體兩性電解質(zhì)pH梯度和固相pH梯度。前者是在電場中通過兩性緩沖離子建立pH梯度，后者是將緩沖基團作為凝膠介質(zhì)的一部分根據(jù)電泳方式不同分為：管狀、薄層、垂直和水平等電聚焦。根據(jù)支持介質(zhì)的不同：①ISO–DALT：在聚丙烯酰胺凝膠中進行,兩性電解質(zhì)在外加電場作用下形成梯度。②IPG–DALT：使用丙烯酰胺和固相化的兩性電解質(zhì)共聚,可形成具有pH梯度的凝膠，是現(xiàn)在主要和常用的方法。③非平衡pH梯度電泳蛋白質(zhì)分子的電聚焦過程

+pI1

pI2

pH=pIpI3

pIn-

abc

蛋白質(zhì)分子在負(fù)極端蛋白質(zhì)分子在正極端蛋白質(zhì)樣品中各組分聚焦成區(qū)帶

—+等點聚焦（IEF）IPG膠條平衡

膠條由一向轉(zhuǎn)移到二向之前,必須進行平衡,目的主要是進行蛋白質(zhì)的烷基化以及讓電泳介質(zhì)達到與二向SDS相同的緩沖體系。烷基化的目的是對蛋白質(zhì)自由巰基進行修飾,使斷開的二硫鍵不會再重新形成SDS-PAGE

SDS–PAGE：利用蛋白質(zhì)分子量大小的不同，使其在電泳中分離。第二向SDS-PAGE在恒溫下進行,一般采用1.5～1mm厚的聚丙烯酰胺凝膠,進行5～8小時左右。起始時用低電流或低電壓,樣品在完全走出一向膠條時,再加大電流(或電壓),待指示劑達到底部邊緣時即可停止電泳。SDS-PAGE染色銀染法：靈敏度高，可以在電泳圖中找到含量較低的蛋白，所需的上樣量較少（每點僅需0.1ng），可以檢測到小于1ng的蛋白點，但線性范圍小于2個最高數(shù)量級。對溫度依賴性大，而且需要精確控時的操作考馬斯亮蘭：靈敏度較低，檢測限度約為每點10ng蛋白，但可以染色多種蛋白質(zhì)，并能與蛋白量呈兩個最高數(shù)量級的線性關(guān)系。熒光染色法：一種終點染色方法，可以檢測到大約1ng的蛋白點。熒光染色法與蛋白量呈3個最高數(shù)量級的線性關(guān)系，需用熒光掃描儀顯示用熒光染色法染色的蛋白點。圖像分析及數(shù)據(jù)處理大腸桿菌全蛋白提取液雙向電泳凝膠染色后照片將染色后的凝膠放在GS-710光密度掃描儀上，掃描后的圖像用PDQUEST2D軟件分析，選擇部分匹配的蛋白質(zhì)斑點進行比較。應(yīng)用雙向電泳技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)中發(fā)揮著重要的作用,可用于研究樣品總蛋白、不同樣品蛋白質(zhì)表達差異、蛋白質(zhì)間相互作用、蛋白質(zhì)修飾等。2-DE凝膠圖譜斑點是以計算機為基礎(chǔ)的圖像分析軟件,包括斑點檢測、背景消減、斑點配比和數(shù)據(jù)庫構(gòu)建等在內(nèi)的圖像分析,將凝膠上的斑點數(shù)字化,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白即可以獲得關(guān)于被檢測蛋白其等電點和分子量的信息,從而用于建立數(shù)據(jù)庫。2-DE技術(shù)還廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究工作,如通過斑點對比,尋找差異蛋白,從而發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)蛋白,尋找用于診斷的疾病相關(guān)標(biāo)記分子,尋找疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)藥靶,以用于藥物設(shè)計,研究疾病的致病機理等。蛋白質(zhì)的翻譯后修飾和加工亦可通過雙向凝膠電泳蛋白質(zhì)點的矢量圖確定。質(zhì)譜質(zhì)譜簡介MassSpectra

↓↓

質(zhì)量光譜↓

片段→分析→譜圖→“質(zhì)量”原理質(zhì)譜用于結(jié)構(gòu)分析有點像：分析基本原理：樣品分子離子化后，根據(jù)不同離子間的質(zhì)荷比(m/z)的差異來分離并確定分子量。具體流程Sample?PurificationDigestionManySpectraSerumAlbumin

Myosin

CytochromeC

EscheriaColi….?IdentificationMassMeasurer應(yīng)用小分子有機物質(zhì)的檢測

有機大分子物質(zhì)的檢測

新的離子化技術(shù)的出現(xiàn)，如介質(zhì)輔助的激光解析/離子化、電噴霧離子化。蛋白質(zhì)組信息學(xué)

生物信息學(xué)已經(jīng)成為當(dāng)代生物學(xué)和醫(yī)藥學(xué)的組成部分,用于巨量生物信息資源的收集、存儲、處理、搜索、利用、共享、服務(wù)、研究和開發(fā)。它常由數(shù)據(jù)庫、計算機網(wǎng)絡(luò)和應(yīng)用軟件三大部分組成。在基因組計劃中它已經(jīng)發(fā)揮了不可取代的作用,而在蛋白質(zhì)組計劃中也日益成為強力的支撐。不過,蛋白質(zhì)組比基因組具有更大的復(fù)雜性,因而蛋白質(zhì)組信息學(xué)更有挑戰(zhàn)性。蛋白質(zhì)組比基

因組具有更大的復(fù)雜性基因組是內(nèi)稟的和固定的,蛋白質(zhì)組則是隨發(fā)育階段、駐留組織甚至所處環(huán)境的變遷而變化的。98%的人類疾病是多基因的和/或后成的(polygenic,epigenetic),疾病的診斷和治療的選擇可能完全依賴于后成的調(diào)節(jié)以及患者所處的環(huán)境。

組織中mRNA的豐度與蛋白質(zhì)的豐度的統(tǒng)計相關(guān)是不顯著的,例如Anderson等用人肝細(xì)胞測得的相關(guān)系數(shù)是0.48。幾乎所有的蛋白質(zhì)都會經(jīng)受翻譯后修飾,從水解切割到特異殘基的共價修飾,僅后者就有200多種之多。因此,蛋白質(zhì)信息學(xué)的內(nèi)容與配置有很多特殊之處。

蛋白質(zhì)組的交互網(wǎng)Figure3-35.Threelevelsoforganizationofaprotein.(Alberts-MolecularBiologyoftheCell)聯(lián)邦數(shù)據(jù)庫

各實驗室建立蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫的技術(shù)和體制往往是不完全相同的,但可在因特網(wǎng)上超文本連通,形成聯(lián)邦數(shù)據(jù)庫.ProteinStructureFigure3-35.Threelevelsoforganizationofaprotein.(Alberts-MolecularBiologyoftheCell)聯(lián)邦數(shù)據(jù)庫各實驗室建立蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫的技術(shù)和體制往往是不完全相同的,但可在因特網(wǎng)上超文本連通,形成聯(lián)邦數(shù)據(jù)庫.聯(lián)邦數(shù)據(jù)庫各實驗室建立蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫的技術(shù)和體制往往是不完全相同的,但可在因特網(wǎng)上超文本連通,形成聯(lián)邦數(shù)據(jù)庫.聯(lián)邦數(shù)據(jù)庫