歐李愈傷組織誘導(dǎo)及培養(yǎng)研究

歐李愈傷組織誘導(dǎo)及培養(yǎng)研究

近年來，植物組織培養(yǎng)的安全性取得了很大進(jìn)展，大多數(shù)重要的果樹種類都涉及到了果樹上。有近300種果樹類植物器官外植體經(jīng)過脫分化后,再分化成不定芽,不少果樹種類再生植株獲得成功。優(yōu)系歐李[Cerasushumilis(Bge.)Sok]是李屬的新果樹,具有優(yōu)良的生物學(xué)特性,果實(shí)艷麗,風(fēng)味獨(dú)特,營養(yǎng)豐富,且花期觀賞價值極高,集多種用途于一身。為了盡快擴(kuò)大優(yōu)系歐李的種植規(guī)模,將其推向市場,作者以優(yōu)系歐李的莖、葉為外植體,進(jìn)行了愈傷組織的誘導(dǎo)與培養(yǎng)以及植株再生的研究,試圖在短期內(nèi)獲取大量的優(yōu)質(zhì)種苗,現(xiàn)已取得較好的結(jié)果。1材料和方法1.1外植體的預(yù)處理采用2年生歐李實(shí)生苗,于早春將植株移入花盆培養(yǎng),從萌發(fā)的嫩枝上剪取莖段和葉片做外植體,以自來水流沖洗20~30min,再以吐溫-20(Twain-20)溶液洗滌,自來水沖洗直至洗掉全部泡沫,后用70%酒精浸泡30~50s,無菌水沖洗4~6次,備用。1.2愈傷組織的誘導(dǎo)分化誘導(dǎo)愈傷組織發(fā)生的基本培養(yǎng)基為改良MS和WPM2種。每種基本培養(yǎng)基分別附加不同質(zhì)量濃度的2,4-D,NAA,IBA,BA,添加卡拉膠0.65%,蔗糖3%,pH5.8。將消毒的嫩莖切成0.3~0.5cm的莖段,葉片切成0.3~0.5cm2大小,通過無菌操作接種到培養(yǎng)基上,培養(yǎng)溫度25~28℃,光照度1500~2000lx,光照時長12~14h/d。愈傷組織誘導(dǎo)分化的基本培養(yǎng)基分別設(shè)為1/2MS、1/3MS、1/4MS和WPM4種。在每種培養(yǎng)基中附加BA的質(zhì)量濃度為1,2,3mg/L,共12種培養(yǎng)基組合,卡拉膠和蔗糖質(zhì)量濃度同誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基。從愈傷組織培養(yǎng)中選擇生長正常、分化良好的愈傷組織切塊轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基上,培養(yǎng)條件同前,每3~5d觀察1次。2結(jié)果與分析2.1受傷后組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)2.1.1誘導(dǎo)愈傷組織的測定結(jié)果見表1,2。從表1,2可以看出,以改良MS為基本培養(yǎng)基,附加生長素2,4-D或NAA或IBA誘導(dǎo)愈傷組織的脫分化培養(yǎng)中,試驗(yàn)所設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基均能誘導(dǎo)出愈傷組織,但愈傷組織發(fā)生的時間、愈傷組織質(zhì)量、愈傷組織的大小和存活期等均不相同。在以葉片為外植體的處理中,培養(yǎng)基附加NAA或2,4-D的質(zhì)量濃度低于0.2mg/L,經(jīng)10d培養(yǎng)均未產(chǎn)生愈傷組織;只有當(dāng)質(zhì)量濃度高于0.2mg/L時,才能誘導(dǎo)愈傷組織。以莖段為外植體的處理也出現(xiàn)類似現(xiàn)象。隨著生長素質(zhì)量濃度的增加,莖或葉愈傷組織的發(fā)生量增大,愈傷組織生長速度加快,但愈傷組織顏色變褐,當(dāng)2,4-D質(zhì)量濃度達(dá)到4.0mg/L時愈傷組織發(fā)生受到抑制,質(zhì)量極差,存活期短。試驗(yàn)結(jié)果表明,改良MS培養(yǎng)基附加NAA質(zhì)量濃度0.40~1.00mg/L和IBA0.20~0.50mg/L的處理誘導(dǎo)葉愈傷組織的效果較好,附加2,4-D誘導(dǎo)莖愈傷組織較為適宜的質(zhì)量濃度范圍為0.15~0.50mg/L,NAA為0.04~0.30mg/L。2.1.2激素質(zhì)量濃度對葉愈傷組織質(zhì)量的影響對改良MS培養(yǎng)基中分別附加不同質(zhì)量濃度的NAA(或2,4-D)+BA的組合試驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn),不同激素質(zhì)量濃度處理的培養(yǎng)基均能產(chǎn)生愈傷組織,而且產(chǎn)生愈傷組織的速度和質(zhì)量均較只用生長素效果好,可能得到良好的愈傷組織(多為淺綠色,較致密,呈粒狀,愈傷塊大,存活期一般在20d以上)(見表3)。從表3看出,改良MS培養(yǎng)基附加激素質(zhì)量濃度低于2,4-D0.40mg/L+BA0.08mg/L有利于莖段愈傷組織的分化,而且愈傷組織形成時間短,愈傷組織質(zhì)量好。其中改良MS培養(yǎng)基附加2,4-D0.20mg/L+BA0.04mg/L是適宜的莖段愈傷組織分化培養(yǎng)基。但對于葉片來說,盡管有的培養(yǎng)基上愈傷組織發(fā)生多,愈傷組織形成時間短,但愈傷組織質(zhì)量差?？偟目磥?葉片愈傷組織形成的時間要比莖段時間長。一般隨激素質(zhì)量濃度的增大,葉愈傷組織形成的時間縮短,質(zhì)量好。當(dāng)2,4-D質(zhì)量濃度增加到4.00mg/L、BA質(zhì)量濃度增至0.40mg/L時,葉片愈傷組織形成受到抑制。莖段在供試激素質(zhì)量濃度的范圍內(nèi),一般愈傷組織形成的速度相近,當(dāng)2,4-D質(zhì)量濃度增至4.00mg/L、BA質(zhì)量濃度為0.40mg/L時也抑制其發(fā)生,莖段愈傷組織發(fā)生量隨激素質(zhì)量濃度增大而減少,愈傷組織質(zhì)量差。隨著NAA+BA的質(zhì)量濃度增大,葉愈傷組織數(shù)量增多,愈傷組織質(zhì)量提高,愈傷組織形成時間短。當(dāng)激素質(zhì)量濃度增大到NAA1.00mg/L+BA0.2mg/L時,無論是愈傷組織質(zhì)量和數(shù)量還是愈傷組織形成的速度、存活時間長短都是最好的。但是當(dāng)激素質(zhì)量濃度繼續(xù)增大到NAA4.00mg/L+BA0.4mg/L時,葉愈傷組織質(zhì)量變差,這說明愈傷組織誘導(dǎo)受到了抑制(見表4)。從表4中還可以看到,在改良MS附加NAA和BA的質(zhì)量濃度低于NAA0.40mg/L+BA0.08mg/L時,盡管愈傷組織的顏色和致密度都正常,但愈傷組織的發(fā)生量少,而且愈傷組織形成的速度也慢,不適于作為愈傷組織分化培養(yǎng)基。2.2不確定芽苗的再生2.2.1d后愈傷組織的增殖從外植體上誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基上,5~7d后所有愈傷組織均在愈傷組織塊的邊緣產(chǎn)生出新的淺綠色呈粒狀的無性胚性組織,愈傷組織在分化培養(yǎng)基上均有不同程度的增殖,莖段的愈傷組織再分化顯然為有效再分化。2.2.2莖尖的色薄膜對根據(jù)表5,5號和10號2個培養(yǎng)基上培養(yǎng)的莖段愈傷組織有不定芽的分化,并逐漸長成叢生苗。其中以5號培養(yǎng)基(1/3MS+BA3mg/L)轉(zhuǎn)接14d后在愈傷組織表面見一突起,外包無色薄膜,2d后露出幼芽,之后幼葉展開,莖尖明顯可見。后14d從愈傷組織側(cè)翼又長出3枚芽,再后又圍繞中間的芽長出9個芽,并開始生長形成叢生芽苗。1個月后苗高生長0.2~0.9cm,先長出的芽苗生長快。10號培養(yǎng)基(1/3MS+BA2mg/L)轉(zhuǎn)接后10d左右在愈傷組織上形成一個小突起,經(jīng)過3~5d長大成芽,7~9d后從芽苗基部長出數(shù)個小芽,呈叢生狀。1個月后最高長到1.5cm。以上2個培養(yǎng)基的不定芽誘導(dǎo)率分別為42%和38%;10號培養(yǎng)基雖然芽苗誘導(dǎo)率低于5號,但芽苗生長良好,故選用該培養(yǎng)基作為不定芽分化的最佳培養(yǎng)基。3誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基(1)改良MS培養(yǎng)基適宜作歐李莖、葉誘導(dǎo)分化愈傷組織的基本培養(yǎng)基。供試處理均能產(chǎn)生愈傷組織,但愈傷組織產(chǎn)生的快慢和質(zhì)量不同。附加生長素和細(xì)胞分裂素的組合使用比單一附加生長素的愈傷組織發(fā)生快、質(zhì)量好。(2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,葉誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基以附加NAA和BA效果較好,莖段誘導(dǎo)愈傷組織以附加2,4-D和BA為好,說明不同的器官誘導(dǎo)愈傷組織對激素的需求是不同的。誘導(dǎo)愈傷組織的各種處理都表明,在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)隨著附加激素濃度的升高,愈傷組織增多,質(zhì)量漸好,但