熒光免疫試驗(yàn)

關(guān)于熒光免疫試驗(yàn)第1頁，共53頁，編輯于2022年，星期六掌握：熒光的基本知識(shí)；熒光抗體染色與結(jié)果判斷。熟悉：熒光物質(zhì)。了解：熒光抗體的制備；熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)；熒光免疫分析；熒光免疫技術(shù)的應(yīng)用。教學(xué)目的第2頁，共53頁，編輯于2022年，星期六第一節(jié)熒光免疫試驗(yàn)的組成因素第二節(jié)間接免疫熒光試驗(yàn)第三節(jié)流式熒光免疫試驗(yàn)第四節(jié)其他與熒光檢測(cè)相關(guān)的免疫試驗(yàn)第五節(jié)熒光免疫試驗(yàn)的臨床應(yīng)用第六節(jié)影響熒光免疫試驗(yàn)的主要因素第3頁，共53頁，編輯于2022年，星期六熒光免疫試驗(yàn)（fluoroimmunoassay):

以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體和抗原，通過與相應(yīng)抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，以此對(duì)待測(cè)物進(jìn)行定位、定性和定量分析的檢測(cè)技術(shù)，具有高度特異性、敏感性和直觀性，是最早出現(xiàn)的免疫標(biāo)記技術(shù)。第4頁，共53頁，編輯于2022年，星期六

熒光物質(zhì)吸收激發(fā)光的能量后，電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)其回復(fù)至基態(tài)時(shí)，以發(fā)射光形式釋放出能量，稱為熒光。第一節(jié)熒光免疫試驗(yàn)的組成要素吸收能量激發(fā)態(tài)

基態(tài)熒光效率第5頁，共53頁，編輯于2022年，星期六熒光特點(diǎn)：

1可產(chǎn)生熒光的分子或原子在接受能量后即刻引起發(fā)光；2一旦停止供能，熒光隨之瞬間消失；第6頁，共53頁，編輯于2022年，星期六(一)熒光的基本知識(shí)1.發(fā)射光譜:指固定激發(fā)光波長(zhǎng)，在不同波長(zhǎng)下記錄到的標(biāo)本發(fā)射熒光的譜圖。2.激發(fā)光譜:指固定檢測(cè)發(fā)射光波長(zhǎng)，用不同波長(zhǎng)的激發(fā)光照射標(biāo)品得到的熒光的譜圖。

一熒光及熒光物質(zhì)基礎(chǔ)知識(shí)第7頁，共53頁，編輯于2022年，星期六熒光效率

＝吸收光的光量子數(shù)（激發(fā)光強(qiáng)度）發(fā)射熒光的光量子數(shù)（熒光強(qiáng)度）熒光色素本身的物理特性激發(fā)光強(qiáng)度及激發(fā)光波長(zhǎng)決定于決定于3.熒光物質(zhì)將吸收的光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率------熒光效率第8頁，共53頁，編輯于2022年，星期六定義:熒光物質(zhì)被激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光衰減到一定程度時(shí)所用的時(shí)間。各種熒光物質(zhì)的熒光壽命不同。

4.熒光壽命第9頁，共53頁，編輯于2022年，星期六5.熒光淬滅:熒光物質(zhì)在某些理化因素作用下，發(fā)射熒光減弱甚至消退稱為熒光淬滅。如紫外線照射、高溫（≥20℃）、苯胺、酚、硝基苯、I-等。第10頁，共53頁，編輯于2022年，星期六如何避免：勿長(zhǎng)時(shí)間照射脈沖瞬間照射避光保存猝滅劑：具有熒光猝滅作用的物質(zhì)熒光淬滅

第11頁，共53頁，編輯于2022年，星期六熒光物質(zhì)最大吸收光譜最大發(fā)射光譜應(yīng)用異硫氰酸熒光素(FITC)490～495nm520～530nm（黃綠色）FAT、熒光偏振免疫測(cè)定四乙基羅丹明(RB200)570～575nm595～600nm（橙紅色）FITC的襯比染色或雙標(biāo)記FAT藻紅蛋白（PE）490-560nm595nm（紅色）雙標(biāo)記FAT、流式細(xì)胞術(shù)7-氨基-4-甲基香豆素354nm430nm（藍(lán)色）雙標(biāo)記或多標(biāo)記FATEu3+螯合物340nm613nm時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定（二）熒光物質(zhì)第12頁，共53頁，編輯于2022年，星期六熒光顯微鏡

利用一定波長(zhǎng)的激發(fā)光對(duì)待測(cè)標(biāo)本進(jìn)行激發(fā)，產(chǎn)生一定波長(zhǎng)的熒光，對(duì)組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)或其組分進(jìn)行定性、定位和半定量分析檢測(cè)。

二、熒光顯微鏡第13頁，共53頁，編輯于2022年，星期六隔熱濾光片：位于燈室聚光器前，作用阻斷紅外線通過而隔熱。激發(fā)濾光片：位于光源和物鏡之間，作用能選擇性地透過紫外線可見波長(zhǎng)的光域，提供合適的激發(fā)光。

吸收濾光片：位于物鏡和目鏡之間，作用阻斷激發(fā)光而使發(fā)射的熒光透過，保護(hù)眼睛。熒光顯微鏡濾光片第14頁，共53頁，編輯于2022年，星期六透射光：照明光線從標(biāo)本下經(jīng)聚光器透過標(biāo)本進(jìn)入物鏡。落射光：照明光線從標(biāo)本上經(jīng)垂直照明器落射到標(biāo)本，經(jīng)標(biāo)本反射進(jìn)入物鏡。透射熒光顯微鏡光路(a)落射熒光顯微鏡光路(b)熒光顯微鏡光路第15頁，共53頁，編輯于2022年，星期六第16頁，共53頁，編輯于2022年，星期六第17頁，共53頁，編輯于2022年，星期六1、抗體要求

高特異性高親和力經(jīng)純化提取IgG

三、熒光素-抗體結(jié)合物第18頁，共53頁，編輯于2022年，星期六有能與蛋白質(zhì)形成共價(jià)健的化學(xué)基團(tuán)熒光效率高，熒光色澤與背景組織的色澤對(duì)比度高。與蛋白質(zhì)結(jié)合后不影響蛋白質(zhì)原有性質(zhì)。標(biāo)記方法簡(jiǎn)單、安全無毒。與蛋白質(zhì)的結(jié)合物穩(wěn)定，易于保存。2熒光素要求第19頁，共53頁，編輯于2022年，星期六一、基本原理特異性抗體與相應(yīng)抗原反應(yīng)，熒光素標(biāo)記的抗抗體再與第一抗體結(jié)合。

間接熒光抗體染色法示意圖

第二節(jié)間接免疫熒光試驗(yàn)第20頁，共53頁，編輯于2022年，星期六間接免疫熒光法示意圖第21頁，共53頁，編輯于2022年，星期六第22頁，共53頁，編輯于2022年，星期六間接法：

優(yōu)點(diǎn)：敏感度高于直接法制備一種熒光抗體可檢測(cè)多種抗原既可用于檢測(cè)抗原，也可檢測(cè)抗體缺點(diǎn)：易出現(xiàn)非特異性熒光方法較麻煩操作時(shí)間較長(zhǎng)應(yīng)用：自身抗體的檢測(cè)第23頁，共53頁，編輯于2022年，星期六標(biāo)本片上滴加特異性抗體37℃30minPBS洗滌滴加二抗

37℃30minPBS洗滌鏡檢二、實(shí)驗(yàn)方法第24頁，共53頁，編輯于2022年，星期六三、注意事項(xiàng)1.熒光染色時(shí)間：一小時(shí)內(nèi)或2~8℃保存4小時(shí)，2.三種對(duì)照：①陽對(duì)：陽性血清+熒光標(biāo)記物②陰對(duì)：陰性血清+熒光標(biāo)記物③熒光標(biāo)記物對(duì)照：PBS+熒光標(biāo)記物3.標(biāo)本片需保持濕潤(rùn)，避免干燥4.滴加抗體或熒光標(biāo)記物,始終保持在未知抗原標(biāo)本上第25頁，共53頁，編輯于2022年，星期六

-：無或僅見極微弱熒光。

+：熒光較弱但清楚可見。

++：熒光明亮。

+++：耀眼強(qiáng)熒光。特異熒光強(qiáng)度+以上判定為陽性，對(duì)照光應(yīng)呈-或±。根據(jù)+的血清最高稀釋度判定特異性抗體效價(jià)。

熒光抗體染色及結(jié)果判斷第26頁，共53頁，編輯于2022年，星期六第三節(jié)流式熒光免疫試驗(yàn)流式熒光免疫試驗(yàn)(flowcytometryandfluorescenceimmunoassay):采用人工微球和流式檢測(cè)方式對(duì)可溶性物質(zhì)進(jìn)行高通量分析的檢測(cè)方法。懸浮陣列；流式微球陣列第27頁，共53頁，編輯于2022年，星期六

第四節(jié)

其他與熒光檢測(cè)相關(guān)的免疫試驗(yàn)第28頁，共53頁，編輯于2022年，星期六其他熒光免疫試驗(yàn)時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定熒光酶免疫測(cè)定熒光偏振免疫測(cè)定第29頁，共53頁，編輯于2022年，星期六自發(fā)熒光壽命短:1ns～10ns鑭系元素壽命長(zhǎng):10μs～1000μs短壽命熒光完全衰變后再測(cè)定鑭系元素特異熒光（一）基本原理時(shí)間分辨檢測(cè)原理示意圖1.時(shí)間分辨一、時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定第30頁，共53頁，編輯于2022年，星期六2.stokes位移:激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的波長(zhǎng)差。

stokes位移小，相互干擾，影響結(jié)果準(zhǔn)確性。鑭系元素Stokes位移大(273nm)，激發(fā)光譜和發(fā)射光譜不重疊時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定第31頁，共53頁，編輯于2022年，星期六發(fā)射光譜帶較窄：613nm±10nm，干擾少激發(fā)光譜帶較寬：300nm～350nm，靈敏度高3.發(fā)射光譜和激發(fā)光譜時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定第32頁，共53頁，編輯于2022年，星期六4.熒光標(biāo)記物的相對(duì)比活性比活性：?jiǎn)挝粫r(shí)間內(nèi)每個(gè)標(biāo)記分子可被探測(cè)到的信號(hào)量。Eu3+螯合物反復(fù)激發(fā)1000次/秒大大提高了熒光標(biāo)記物比活性時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定第33頁，共53頁，編輯于2022年，星期六結(jié)合β-二酮體Eu3+解離酸性增強(qiáng)液熒光增強(qiáng)Eu3+標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物5.信號(hào)增強(qiáng)時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定第34頁，共53頁，編輯于2022年，星期六（二）標(biāo)記物和標(biāo)記方法時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定第35頁，共53頁，編輯于2022年，星期六（三）方法類型

雙抗體夾心法固相抗體競(jìng)爭(zhēng)法固相抗原競(jìng)爭(zhēng)法時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定第36頁，共53頁，編輯于2022年，星期六（三）方法類型時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定（雙抗體夾心法）示意圖第37頁，共53頁，編輯于2022年，星期六靈敏度高：最小檢出量10-18mol/L分析范圍寬：4～5個(gè)數(shù)量級(jí)標(biāo)記物穩(wěn)定：有效使用期長(zhǎng)測(cè)量快速，易自動(dòng)化易受污染，本底增高方法評(píng)價(jià)時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定第38頁，共53頁，編輯于2022年，星期六光線通過偏振濾光片后，形成一個(gè)方向的平面光稱為偏振光。偏振熒光(綠光,525nm～550nm)偏振光(藍(lán)光,485nm)熒光物質(zhì)二、熒光偏振免疫測(cè)定第39頁，共53頁，編輯于2022年，星期六

抗原抗體競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)AgF分子小，轉(zhuǎn)動(dòng)速度快，偏振熒光弱

AgF-Ab分子大，轉(zhuǎn)動(dòng)速度慢，偏振熒光強(qiáng)若待檢抗原多，則AgF-Ab少，AgF多，偏振熒光弱待檢抗原含量與偏振熒光強(qiáng)度成反比熒光偏振免疫測(cè)定原理示意圖基本原理第40頁，共53頁，編輯于2022年，星期六方法評(píng)價(jià)

樣品用量少熒光素標(biāo)記試劑穩(wěn)定，使用壽命長(zhǎng)重復(fù)性好快速，易自動(dòng)化適于小、中等分子物質(zhì)檢測(cè)靈敏度較非均相熒光免疫測(cè)定法低熒光偏振免疫測(cè)定第41頁，共53頁，編輯于2022年，星期六

第五節(jié)熒光免疫試驗(yàn)的臨床應(yīng)用

第42頁，共53頁，編輯于2022年，星期六1.血清中自身抗體檢測(cè)抗核抗體(均質(zhì)型)抗核抗體(核膜型)抗核抗體(斑點(diǎn)型)一、間接免疫熒光試驗(yàn)第43頁，共53頁，編輯于2022年，星期六2.各種微生物的快速檢查和鑒定寄生蟲（猴胚腎細(xì)胞內(nèi)弓形蟲）細(xì)菌（藤黃微球菌)一、間接免疫熒光試驗(yàn)第44頁，共53頁，編輯于2022年，星期六腫瘤（人肝癌細(xì)胞）間接免疫熒光試驗(yàn)3、寄生蟲感染的診斷4、白細(xì)胞分化抗原的檢測(cè)5、人類白細(xì)胞抗原的檢測(cè)6、腫瘤組織中腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)7、激素和酶的組織定位第45頁，共53頁，編輯于2022年，星期六（一）時(shí)間分辨熒光免疫試驗(yàn)二、其他熒光免疫試驗(yàn)1.內(nèi)分泌學(xué)中的應(yīng)用2.腫瘤學(xué)中的應(yīng)用3.免疫學(xué)中的應(yīng)用4.分子生物學(xué)的應(yīng)用5.微生物學(xué)中的應(yīng)用（二）熒光偏振免疫試驗(yàn)第46頁，共53頁，編輯于2022年，星期六第六節(jié)、影響熒光免疫試驗(yàn)的主要因素一、熒光素-抗體結(jié)合物二、待檢標(biāo)本三、其他第47頁，共53頁，編輯于2022年，星期六熒光素-抗體結(jié)合物的結(jié)合比率：

F/P=一、熒光素-抗體結(jié)合物抗體效價(jià)：雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)抗體純度：高親和力、單克隆抗體抗體特異性：吸收試驗(yàn)、抑制試驗(yàn)第48頁，共53頁，編輯于2022年，星期六熒光素與蛋白質(zhì)結(jié)合的比率（F/P）------熒光素結(jié)合到抗體蛋白上的量是標(biāo)記抗體質(zhì)量鑒定的重要指標(biāo)F/P值越高，說明抗體分子上結(jié)合的熒光素越多第49頁，共53頁，編輯于2022年，星期六組織標(biāo)本：冷凍切片、