egcg對人胰腺癌細(xì)胞panc-1增殖的影響

egcg對人胰腺癌細(xì)胞panc-1增殖的影響

目前，許多胰腺患者的治療時(shí)間屬于晚期，手術(shù)切除率低，能夠手術(shù)切除的患者的隨訪率高。胰腺癌的低切除率和高復(fù)發(fā)率決定了化療在胰腺癌的綜合治療中仍有重要地位,但胰腺癌的化療效果并不理想,其主要原因歸結(jié)于胰腺癌是天然耐藥的腫瘤之一。缺氧是實(shí)體腫瘤內(nèi)普遍存在的現(xiàn)象,腫瘤的缺氧微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞發(fā)生耐藥、惡性轉(zhuǎn)化甚至轉(zhuǎn)移的始動(dòng)因素。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是綠茶中的主要成分,同時(shí)也是抗腫瘤作用的活性成分,能在轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平阻斷缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)的表達(dá),抑制HIF-1α在腫瘤中的轉(zhuǎn)錄活性,進(jìn)而發(fā)揮其抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。本研究擬選取人胰腺癌PANC-1細(xì)胞系,通過給予不同劑量的EGCG,觀察其對胰腺癌PANC-1細(xì)胞增殖的影響,從而為探討逆轉(zhuǎn)胰腺癌多藥耐藥的可行性奠定分子學(xué)基礎(chǔ)。1材料和方法1.1材料和試劑1.1.1細(xì)胞人胰腺癌PANC-1細(xì)胞株來自美國ATCC人胰腺癌株P(guān)ANC-1(ATCCnumber:CRL-1469),由本所引進(jìn)。1.1.2胎牛和cck-8試劑DMEM高糖培養(yǎng)基購自Gibco公司。胎牛血清購自中國杭州四季青公司。CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所。EGCG購自浙江一新制藥股份有限公司。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1普通co培養(yǎng)模式常氧培養(yǎng)胰腺癌PANC-1細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基,另添加抗生素(100U/mL青霉素和100mg/L鏈霉素),置于37℃、5%CO2、飽和濕度的普通CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。缺氧培養(yǎng):將細(xì)胞置于1%O2、5%CO2、94%N2、37℃、飽和濕度的三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長達(dá)對數(shù)生長期時(shí),用0.25%胰蛋白酶消化,傳代接種于100mL的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。每瓶細(xì)胞密度為2×105mL,每瓶加入2mL培養(yǎng)基。1.2.2細(xì)胞充質(zhì)ecgg取對數(shù)生長期的PANC-1細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,按每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于3個(gè)96孔板中(每孔100μL),置于37℃、含5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,待細(xì)胞貼壁生長融合至80%時(shí),分別加入終濃度為10、20、40、60、80、100、160μg/mL的EGCG,每一濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔,以不含EGCG培養(yǎng)基的細(xì)胞作為陰性對照,為空白孔調(diào)零。細(xì)胞轉(zhuǎn)置37℃、含1%O2、5%CO2和95%N2飽和濕度的缺氧培養(yǎng)箱中持續(xù)缺氧培養(yǎng)12、24、48h。分別缺氧培養(yǎng)12、24、48h后拿出96孔板在酶標(biāo)儀475nm處測定各孔的吸光值(A)。按以下公式計(jì)算抑制率:抑制率(%)=[1-(實(shí)驗(yàn)組平均A值-調(diào)零組平均A值)]/(對照組平均A值-調(diào)零組平均A值)×100%。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理ss所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,以SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2panc-1細(xì)胞增殖抑制作用EGCG對PANC-1細(xì)胞增殖的影響:CCK-8結(jié)果顯示,不同濃度的EGCG(10、20、40、60、80、100、160μg/mL)均能有效抑制PANC-1細(xì)胞的增殖,且其抑制作用呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性;并隨著作用時(shí)間的延長其抑制作用顯著增強(qiáng),呈現(xiàn)出明顯的時(shí)間依賴性(見圖1、表1)。160μg/mLEGCG作用48h后,PANC-1細(xì)胞的生長抑制率高達(dá)(91.03±2.32)%。3氧防治腫瘤的作用機(jī)制多藥耐藥(MDR)是指在腫瘤化療中細(xì)胞對于一種化療藥物產(chǎn)生耐受后,同時(shí)對其他同一或非同一類型的化療藥物也產(chǎn)生耐藥性。MDR最早是在腫瘤化療中發(fā)現(xiàn)的,通常被描述為在細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)這兩個(gè)不相關(guān)方面的同步的耐藥抵抗。美國癌癥協(xié)會(huì)曾經(jīng)統(tǒng)計(jì)過,大約90%以上腫瘤病人的死亡在不同程度上與耐藥性有關(guān)。而胰腺癌化療效果不佳的原因是多方面的,包括局部的藥代動(dòng)力學(xué)、血胰屏障以及胰腺癌細(xì)胞對化療藥物的天然耐藥性等,最主要的原因還應(yīng)該歸咎于腫瘤細(xì)胞的耐藥性。實(shí)驗(yàn)證明與其他腫瘤相比,體外培養(yǎng)胰腺癌細(xì)胞對目前常用化療藥物的敏感性較差。40例胰腺癌細(xì)胞中僅有4例(10%)篩選到抑制率大于85%的藥物,各藥物的平均抑制率也明顯低于同期實(shí)驗(yàn)中的胃癌。氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶、絲裂霉素、長春地辛、羥基喜樹堿、依托泊甙、順鉑、表阿霉素、吡柔比星和健擇10種化療藥物中,平均抑制率>40%的藥物僅有絲裂霉素、健擇和5-氟尿嘧啶,并且與其他藥物比較未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這說明胰腺癌化療效果不佳與其天然的耐藥性有關(guān)。低氧導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥的機(jī)制較為復(fù)雜,主要有以下幾方面:①實(shí)體瘤內(nèi)血管結(jié)構(gòu)和功能的異常,使腫瘤組織壞死出血形成血栓,血流不暢,藥物不易到達(dá)腫瘤內(nèi)部,從而不能達(dá)到抗腫瘤的效果。②低氧能抑制腫瘤細(xì)胞增殖。體外低氧處理能特異性地抑制S期細(xì)胞DNA復(fù)制的啟動(dòng),表現(xiàn)為細(xì)胞增殖率隨血管距離的增大而減少,而大多數(shù)抗腫瘤藥物主要作用于快速分裂期的細(xì)胞,故低氧導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對抗腫瘤藥物敏感性下降。③缺氧組織細(xì)胞pH值的變化(低氧組織中pH值約為7.05,正常值約為7.3),可影響抗癌藥的細(xì)胞內(nèi)外分布。④缺氧使多藥耐藥基因表達(dá)增加。⑤低氧是腫瘤發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化甚至轉(zhuǎn)移的啟動(dòng)因子。低氧通過誘發(fā)腫瘤細(xì)胞的遺傳不穩(wěn)定性、篩選喪失凋亡潛力的腫瘤細(xì)胞及誘導(dǎo)多種參與腫瘤細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的基因和蛋白的表達(dá),使腫瘤細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化,這些發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞極易通過缺氧誘生的腫瘤新生血管而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。腫瘤惡性轉(zhuǎn)化甚至轉(zhuǎn)移使抗腫瘤藥物敏感性降低。目前,很多化療藥物在殺滅腫瘤細(xì)胞的同時(shí),也損害了大量正常細(xì)胞,有很強(qiáng)的毒副作用。化療藥物的毒副作用和腫瘤細(xì)胞的耐藥性一樣都是腫瘤治療中難以解決的問題。研發(fā)特異性攻擊腫瘤細(xì)胞、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥性的新型抗腫瘤藥物必然是解決問題的最佳方法。眾所周知,天然物質(zhì)具有毒性小等特點(diǎn),所以從天然物質(zhì)中篩選和分離抗腫瘤的有效成分,尋找腫瘤細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑已成為當(dāng)前腫瘤學(xué)的研究熱點(diǎn)。茶作為天然植物,其抗腫瘤作用的研究一直是腫瘤防治領(lǐng)域的熱點(diǎn)。茶葉是富含多酚類的化合物,包括黃烷醇、黃酮類和茶多酚類,其中大部分為黃烷醇,通稱兒茶素。綠茶中主要的兒茶素有:表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表沒食子兒茶素(EGC)、表兒茶素(EC)等,其中EGCG含量最高,占兒茶素的80%。許多學(xué)者認(rèn)為它是抗腫瘤作用的主要活性成分,自1987年Fujiki等最早報(bào)道EGCG抑制人體癌細(xì)胞以來,許多國家大量的研究報(bào)道揭示了茶的抗癌活性及其機(jī)理,包括了體外研究、體內(nèi)研究、臨床試驗(yàn)和流行病學(xué)調(diào)查等各個(gè)階段,它們證明了茶葉對各種動(dòng)物癌癥,包括皮膚癌、肺癌、口腔癌、胃癌、小腸癌、結(jié)腸癌、肝癌、胰腺癌、直腸癌、前列腺癌等,都有明顯的預(yù)防和治療效果。并且Ullmann等通過給予健康志愿者50～1600mg不同劑量的EGCG,來檢查其安全性、可耐受性及藥物代謝動(dòng)力學(xué)。結(jié)果顯示:即使EGCG給藥劑量達(dá)到1600mg時(shí),志愿者仍然可以較好耐受。本研究為克服MTT的不足,選用新的檢測方法Count-ingKit-8(簡稱CCK-8)法檢測細(xì)胞的增殖情況。CCK-8法的檢測原理與常規(guī)MTT法略有差異,檢測條件也不盡相同,試劑經(jīng)活細(xì)胞線粒體脫氫酶轉(zhuǎn)化后形成水溶性結(jié)晶,可直接進(jìn)行比色,實(shí)驗(yàn)誤差較小。檢測結(jié)果顯示,不同濃度的EGCG(10、20、40、60、80、100、160μg/mL)在缺氧條件下均能有效抑制PANC-1細(xì)胞的增殖,且其抑制作用呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性;并隨