不同品種雞fabp基因多態(tài)性分析

不同品種雞fabp基因多態(tài)性分析

脂肪是影響肉質(zhì)特性的重要因素之一。這是身體的主要成分之一。這是維持正常生活活動(dòng)所必需的物質(zhì)。它在維持動(dòng)物的正常生理功能和生理代謝方面發(fā)揮著重要作用，因此需要充分的脂肪儲(chǔ)備。雞體內(nèi)脂肪蓄積的主要部位是脂肪組織，一定含量的皮下脂肪使胴體外觀較好；肌內(nèi)脂肪（IntramuscularFat,IMF）被認(rèn)為與肉質(zhì)及口感呈正相關(guān)，會(huì)影響肉品的多汁性、嫩度及風(fēng)味。在機(jī)體的脂肪代謝過(guò)程中，脂肪酸結(jié)合蛋白（FattyAcidBindingProtein,FABP）起著重要的生理功能，參與細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的攝取，協(xié)助將脂肪酸運(yùn)至進(jìn)行β-氧化的場(chǎng)所，以及甘油三酯和磷脂的合成部位。FABP主要在對(duì)脂肪酸有高度需求的組織（如心肌、骨骼肌等）和脂肪細(xì)胞中表達(dá)，能在該類組織細(xì)胞中沉積甘油三酯，從而增加肌內(nèi)脂肪。因此，把FABP基因作為影響雞肉質(zhì)性狀的候選基因加以研究，旨在弄清不同雞種FABP基因的遺傳變異、基因型分布差異，繼而以此為分子遺傳標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇，為培育肉質(zhì)細(xì)嫩、風(fēng)味獨(dú)特的優(yōu)質(zhì)雞奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1白羽雞血工酶樣品供試動(dòng)物為湖北紅雞、金水烏雞、武定雞、青腳麻雞、矮黃雞及隱性白羽雞6個(gè)品種，各60只，共360個(gè)血液樣品，采自湖北省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所家禽試驗(yàn)基地。0.2mol·L-1EDTA抗凝，1mL血液用0.1mLEDTA輕輕混勻，制備全血樣品。1.2k-l-1和sds-1的制備基因組DNA的提取根據(jù)孟安明的方法，稍加調(diào)整，即取50μL雞全血，加入450μL1×SET溶液，8μL25%SDS和15μL蛋白酶K(10mg·mL-1，充分混勻后，50℃恒溫?fù)u動(dòng)40r·min-1）消化過(guò)夜。經(jīng)酚仿抽提與乙醇沉淀，獲得基因組DNA，干燥后加入50～100μLTE(pH8.0）于55℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜，以使DNA充分溶解，將獲得的DNA樣品分成兩份，一份于4℃?zhèn)溆茫硪环萦?20℃保存。1.3fabp基因第2內(nèi)含子的擴(kuò)增在GeneBank上查到，在雞脂肪cDNA文庫(kù)中有一段523bp序列（BI067866）與豬、牛等哺乳動(dòng)物FABP基因第2外顯子和第3外顯子堿基序列之間有數(shù)十個(gè)堿基相當(dāng)保守，在此保守區(qū)設(shè)計(jì)引物用于擴(kuò)增雞FABP基因第2內(nèi)含子，采用Primer3.0軟件設(shè)計(jì)引物，由上海基康生物技術(shù)有限公司合成，引物序列為：上游引物5′-agcaccttcaagaacacagaga-3′，下游引物5′-gaccagcttgcctccatcta-3′，預(yù)計(jì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小約2kb。1.4pcr反應(yīng)體系PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min,94℃變性30s,62℃退火30s,72℃延伸2min，經(jīng)34個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。PCR反應(yīng)體系：反應(yīng)總體積為25μL，各組分濃度為dNTPs0.2mmol·L-1,Mg2+1.5mmol·L-1，上下游引物各0.5μmol·L-1,Taq酶2.5U，模板DNA1μL。擴(kuò)增產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)，Marker(M1）用200bpDNALadder（華美生物工程公司）。1.5酶切反應(yīng)及產(chǎn)物選用HhaⅠ、HaeⅢ、HinfⅠ、BamHⅠ、EcoRⅠ和PstⅠ6種限制性內(nèi)切酶對(duì)雞FABP基因第2內(nèi)含子擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行單酶切。酶切反應(yīng)體系：反應(yīng)總體積為12μL，其中含8μLPCR產(chǎn)物，1.2μL限制性內(nèi)切酶10×Buffer,2.3μL高壓滅菌雙蒸水，0.5μL(5～8U）限制性內(nèi)切酶，于37℃消化過(guò)夜。酶切產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)，Marker選用M1和M2(pBR322DNA/MspⅠMarkers），均為華美生物工程公司產(chǎn)品。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1，由圖1可見(jiàn)，擴(kuò)增片段的特異性較好，大小約為2kb，表明PCR擴(kuò)增獲得了目的片段。2.2ha酶切片段經(jīng)6種不同內(nèi)切酶對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行單酶切的結(jié)果表明，僅HhaⅠ的酶切片段存在多態(tài)性（圖2，有AA和AB兩種基因型）。所檢測(cè)的6個(gè)雞群體中，F(xiàn)ABP基因第2內(nèi)含子HhaⅠ-RFLP的基因型頻率與等位基因頻率的分布情況見(jiàn)表1。2.3不同蛋用品種湖北紅雞與其他品種的群體功能差異經(jīng)獨(dú)立性χ2檢驗(yàn)（表2),FABP基因HhaⅠ-RFLP的基因型分布，蛋用品種湖北紅雞與其他品種間存在顯著或極顯著差異，群體中B基因頻率占明顯優(yōu)勢(shì)；矮黃雞與隱性白羽肉雞2個(gè)肉用品種雞與其他品種間也存在顯著或極顯著差異，2個(gè)品種的優(yōu)勢(shì)基因?yàn)锳基因。2結(jié)果2.1pcr擴(kuò)增結(jié)果3fabp基因片段的擴(kuò)增、分析及顯著性研究問(wèn)題結(jié)合胴體外觀、肉質(zhì)口感及6品種雞的不同經(jīng)濟(jì)用途分析，A基因在2個(gè)肉雞品種中占優(yōu)勢(shì)，B基因在蛋雞品種中占明顯優(yōu)勢(shì)，而在另3個(gè)兼用品種中A、B基因分布趨中，據(jù)此初步推測(cè)A基因可能是影響肌內(nèi)脂肪沉積的優(yōu)勢(shì)基因。據(jù)報(bào)道，作為細(xì)胞內(nèi)類脂結(jié)合蛋白的家族，F(xiàn)ABPs至少有8種結(jié)構(gòu)不同的類型，在畜禽上，研究較多的是心臟型FABP(H-FABP）和脂肪型FABP(A-FABP)，本試驗(yàn)擴(kuò)增出的FABP基因片段大小約為2kb，是H-FABP基因，葉滿江等報(bào)道雞H-FABP基因有AA、BB、CC、AB、AC、BC6種基因型，本試驗(yàn)中只出現(xiàn)了AA和AB兩種基因型，這可能與樣本量有關(guān)，擴(kuò)大供試群體可能會(huì)表現(xiàn)出更豐富的FABP基因的遺傳變異。隱性白羽肉雞只有AA型，未檢測(cè)到B型，這可能與其較高的選育程度有關(guān)，或者是因?yàn)锽型在該群體中分布較少所致。肌內(nèi)脂肪是影響雞肉風(fēng)味的一個(gè)重要因素，適宜的肌內(nèi)脂肪含量和均勻分布的脂肪能使肉質(zhì)具有較好的風(fēng)味。由于肌內(nèi)脂肪是胴體性狀，在活體上很難直接測(cè)定，屠宰測(cè)定的代價(jià)昂貴，而且根據(jù)同胞、后裔成績(jī)等進(jìn)行選種選育的常規(guī)育種方法，其選育進(jìn)展緩慢。如果能找出影響肉質(zhì)風(fēng)味的遺