高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)中藥材中的6種砷形態(tài)

高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)中藥材中的6種砷形態(tài)

中醫(yī)學(xué)是中醫(yī)的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)，其質(zhì)量是中醫(yī)藥發(fā)展的基礎(chǔ)。但是近年來,許多中藥材中砷含量嚴(yán)重超標(biāo),制約了中藥材走向世界。各國進(jìn)出口中藥材質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)對(duì)砷總量均做了嚴(yán)格規(guī)定。然而,砷元素的毒性不僅取決于其總量,更取決于其存在的化學(xué)形態(tài),例如無機(jī)砷的毒性最大,甲基胂、二甲基胂毒性較小,而砷甜菜堿、砷糖通常被認(rèn)為是無毒的。雖然砷元素本身具有強(qiáng)烈的致癌作用,但是很多復(fù)方傳統(tǒng)中藥含有砷成分,大量的研究證實(shí),砷作為某些中藥中的有效成分對(duì)疾病的治療起著關(guān)鍵作用,例如雄黃(四硫化四砷,As4S4)、砒霜(三氧化二砷,As2O3)已經(jīng)作為抗血癌藥物進(jìn)入臨床階段。因此,研究中藥材中砷的毒性及藥效,僅測(cè)定砷總量是不夠的,應(yīng)同時(shí)對(duì)砷形態(tài)加以研究。目前,中藥材中砷形態(tài)分析的報(bào)道較少。本課題組融合高效液相色譜色譜(HPLC)高效分離的特點(diǎn)及電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)高靈敏度的元素特異檢測(cè)手段于一體,對(duì)6種中藥材中的多種砷形態(tài)進(jìn)行初步探討。1實(shí)驗(yàn)部分1.1儀器、試藥與標(biāo)準(zhǔn)1100型高效液相色譜(美國Agilent公司),HamiltonPRP-X100(250×4.1mm;10μm)陰離子交換色譜柱;7500a型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)(美國Agilent公司);SpeedwaveMW-3+微波消解系統(tǒng);Milli-Q超純水處理系統(tǒng);快速漩流濃縮儀。HNO3、H2O2、CH3OH均為優(yōu)級(jí)純;碳酸銨為分析純;超純水(≥18.2MΩ)。標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)TORT-2;三碘化砷、五氧化二砷;二甲基胂酸;甲基胂酸、砷膽堿、砷甜菜堿。1.2儀器條件優(yōu)化液相色譜條件:陰離子交換色譜柱HamiltonPRP-X100(250×4.1mm;10μm);流動(dòng)相為:A:H2O,B:50mmol(NH4)2CO3(pH9.5),二元泵梯度洗脫:(1)0～15min,A:100%～0%,B:0%～100%;(2)15～30min,A:0%～100%,B:100%～0%;流速:1.5mL/min,進(jìn)樣量:20μL。ICP-MS條件:用10μg/L的Li、Y、Ce和Tl混合標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)儀器條件進(jìn)行優(yōu)化,使儀器靈敏度、氧化物、雙電荷等各項(xiàng)指標(biāo)達(dá)到測(cè)定要求。RF功率:1350W,載氣流速:0.90L/min,混合氣流速:0.15L/min,采用時(shí)間分辯分析模式。由于35Cl和儀器所用的高純載氣(氬氣)易形成75ClAr+,干擾75As的測(cè)定,因此儀器同時(shí)監(jiān)測(cè)75As,35Cl等信號(hào),用以排除75ClAr+干擾峰。1.3樣品處理1.3.1微波消解法準(zhǔn)確稱取0.2g粉碎后的中藥材于聚四氟乙烯消解罐,加入5mL硝酸密封后放入微波消解儀中運(yùn)行消解程序,待程序執(zhí)行完畢冷卻后,打開消解罐,加入1mLH2O2,反應(yīng)20min。然后將樣品轉(zhuǎn)移至干凈的PET塑料瓶中,稀釋定重至25.00g,即為待測(cè)樣液。1.3.2樣品中砷的提取鹽酸浸提:準(zhǔn)確稱取粉碎后中藥材樣品1.00g于15mL具塞刻度離心管中,加1:10(V/V)HCl10mL,混勻,置于50℃水浴鍋中24h,期間多次振搖,使試樣充分浸提。冷卻、過濾,取2mL濾液于PET瓶中,加超純水定重至20.00g,用于砷的形態(tài)分析。同樣方法提取標(biāo)準(zhǔn)參考物TORT-2中的砷化學(xué)形態(tài)。超聲溶劑提取:準(zhǔn)確稱取粉碎后中藥材樣品1.00g于離心管中,加入10mL甲醇/水(V/V=1:1)超聲30min,然后置于離心機(jī)中以6000r/min旋轉(zhuǎn)15min。小心移出上層清液于100mL圓底燒瓶中。重復(fù)上述步驟3次,將3次合并液在40℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干,所剩殘?jiān)贸兯芙?定重至5.00g,即為待測(cè)樣液。2結(jié)果與討論2.1種藥材中砷含量測(cè)定在砷的形態(tài)分析前,采用微波消解-ICP/MS法對(duì)6種中藥材試樣中的總砷含量進(jìn)行了測(cè)定,結(jié)果見表1。發(fā)現(xiàn)除全蝎外,其它5種中藥材砷含量均符合我國藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(砷≤2.0μg/g),但對(duì)比最嚴(yán)格的美國FDA藥品與功能性食品標(biāo)準(zhǔn)中砷限量(≤0.02μg/g),6種中藥材砷含量均超標(biāo)。此標(biāo)準(zhǔn)對(duì)中藥材中的砷含量進(jìn)行限定時(shí),未對(duì)有毒的無機(jī)砷形態(tài)進(jìn)一步規(guī)定,值得探討。2.2在分析硫異葉結(jié)構(gòu)的方法中2.2.1各砷形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立將濃度為0.00、10.00、100.00μg/L的6種砷形態(tài)混合標(biāo)樣用HPLC-ICP/MS分析,分離結(jié)果見圖1,以所得6種砷形態(tài)的峰面積作工作曲線,在0～100μg/L內(nèi)以As計(jì)呈線性相關(guān),回歸方程見表2。由于ICP-MS靈敏度高、響應(yīng)與化合物結(jié)構(gòu)無關(guān),因此各種砷形態(tài)的峰面積(以As計(jì))只與各砷形態(tài)的濃度呈線性關(guān)系,當(dāng)各砷形態(tài)的濃度為0.00時(shí),其峰面積相應(yīng)也應(yīng)為0,因此本實(shí)驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)曲線過原點(diǎn)。對(duì)濃度為10.00μg/L的混合標(biāo)樣重復(fù)測(cè)定7次,計(jì)算各砷形態(tài)RSD;采用逐級(jí)稀釋法,對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行逐級(jí)稀釋,以3倍的峰高為儀器檢出限,測(cè)得的檢出限見表2。2.2.2asb的提取效率采用超聲溶劑萃取法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)TORT-2中的砷形態(tài)進(jìn)行提取,用所建立的HPLC-ICP-MS分析,結(jié)果見表3,其中AsB的提取效率為73.8%,與文獻(xiàn)中提及的AsB沾水溶性砷形態(tài)的73%一致,證明本方法有較好的準(zhǔn)確性。2.2.3hplc-icp-ms分析對(duì)動(dòng)植物中藥材樣品中的砷形態(tài)進(jìn)行“原位”提取非常重要,直接決定了其中所含砷元素對(duì)藥效影響的評(píng)價(jià)。為了考察提取步驟對(duì)砷形態(tài)分析的影響,以龍蝦肝胰腺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)TORT-2作為參考物,分別采用HCl浸提(HCl)和超聲溶劑萃取(SON)兩種方法對(duì)其進(jìn)行提取比對(duì),其HPLC-ICP-MS分析結(jié)果見表3。由上述表可以看出,標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)TORT-2中最主要的砷形態(tài)是AsB,且用鹽酸浸提法提取出的AsB效率明顯好于超聲溶劑萃取,提取出的砷形態(tài)種類也較多,原因可能是HCl的極性較強(qiáng),易與樣品中的砷形態(tài)化合物發(fā)生作用,浸提出較多的砷形態(tài)。另外,用甲醇/水超聲提取時(shí)總砷提取效率達(dá)到120%,原因是甲醇可提高As的離子化效率,從而增強(qiáng)75As的信號(hào)。因此,如果提取液中的甲醇不能完全蒸干,就會(huì)使總砷提取效率明顯偏高。2.3各藥材中砷形態(tài)的含量用HCl浸提法對(duì)北龍膽、合歡花、紅花、人工養(yǎng)殖全蝎、野生全蝎和桑螵蛸中存在的砷形態(tài)進(jìn)行提取,其結(jié)果如表4所示。從表中可以看出,上述6種中藥材中的砷主要以As(Ⅲ)和As(Ⅴ)的無機(jī)砷形態(tài)存在,全蝎和紅花中As(Ⅲ)含量比As(Ⅴ)高,其它4種中藥材中均是As(Ⅴ)形態(tài)比As(Ⅲ)含量高。另外全蝎、野生全蝎和桑螵蛸3種動(dòng)物藥材中還存在微量的AsB?？梢?中藥材中所含的砷形態(tài)并非全是毒性較高的無機(jī)砷形態(tài),因此有關(guān)中藥質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)中應(yīng)進(jìn)一步限定無機(jī)砷形態(tài)的含量。另外作者還對(duì)比了人工養(yǎng)殖全蝎和野生全蝎中存在的砷形態(tài)差異,發(fā)現(xiàn)人工養(yǎng)殖全蝎和野生全蝎中AsB和As(Ⅴ)形態(tài)含量無明顯差別,而人工養(yǎng)殖全蝎比野生全蝎含有更多的As(Ⅲ)形態(tài)。結(jié)果表明,同種藥材受不同的環(huán)境影響,會(huì)產(chǎn)生一定的差別。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,動(dòng)物體中的砷經(jīng)過體內(nèi)代謝主要以砷甜菜堿(AsB)、砷膽堿(AsC)、砷糖等有機(jī)砷形態(tài)存在,而人工全蝎和野生全蝎中的砷均主要以有毒的無機(jī)As(Ⅲ)、As(Ⅴ)形態(tài)存在,只有很少一部分砷經(jīng)過甲基化及進(jìn)一步代謝成砷甜菜堿(AsB)等幾乎無毒的有機(jī)砷形態(tài)。眾所周知,As(Ⅴ)和As(Ⅲ)具有很高的毒性,但是食用這些中藥材卻有治療疾病的作用,因此清楚解釋中藥材中無機(jī)砷的作用機(jī)理有十分重要的意義。3鹽酸浸提法提取砷形態(tài)的最佳方法是相對(duì)于as、dma、mma、mma、mma、asc的提取利用HPLC-ICP/MS同時(shí)分析了六種中藥材中存在的砷形態(tài)