蔥莖揮發(fā)物及提取液對26種病害的抑菌活性

蔥莖揮發(fā)物及提取液對26種病害的抑菌活性

土壤傳遞障礙的防治是植物病害研究領域的難題。傳統(tǒng)的農業(yè)措施輪作和間作是減輕土傳病害危害的有效措施之一。研究表明,間作和輪作能減輕土傳病害的危害,除了使病原菌失去寄主和增加根際有益微生物的種類和數(shù)量外,作物揮發(fā)或分泌的抑菌物質對土壤中病原菌的抑制是減輕病害的主要原因之一。Gomez-Rodriguez等報道萬壽菊與番茄間作后萬壽菊釋放的化感物質可降低番茄枯萎病菌孢子萌發(fā)率。Ren等研究表明,水稻和西瓜間作過程中水稻根系分泌物可以抑制西瓜枯萎病菌孢子萌發(fā)和菌絲生長。Park等研究表明,玉米可以通過根系分泌(6R)-7,8-二氫-3-氧代-α-紫羅蘭酮和(6R,9R)-7,8-二氫-3-氧代-α-紫羅蘭醇兩種抗菌化合物抑制茄子枯萎病菌的生長。生產實踐也表明,蔥屬作物與其他作物間作或輪作能有效地控制由鐮刀菌、立枯絲核菌等病原菌引起的土傳病害。目前蔥屬作物的抑菌活性研究主要集中于食品和醫(yī)學微生物方面,鮮有對植物病原菌的抑菌活性的系統(tǒng)比較。作者測定了大蒜、洋蔥和蔥3種常見蔥屬作物的揮發(fā)物和浸提液對作物主要病原真菌和卵菌的抑菌活性,以期為合理地利用3種蔥屬作物與其他作物間作或輪作控制病害提供科學依據(jù)。1材料和方法1.1試驗材料1.1.1品中的蚤及a.cepahnn.嘴唇大蒜(AlliumsativumLinn.)鱗莖,品種為‘呈貢蒜’;洋蔥(A.cepaLinn.)鱗莖,品種為‘紫冠’;蔥(A.fistulosumLinn.)莖,品種為‘寒豐’;市售。1.1.2試驗中的蘑菇包括引起植物主要病害的17株真菌和9株卵菌病原菌(表1),由中國農業(yè)大學種子病理與殺菌劑藥理實驗室提供。1.1.3培養(yǎng)基ua馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA):馬鈴薯200g,葡萄糖18g,瓊脂16g,去離子水定容至1L;燕麥培養(yǎng)基(OA):燕麥45g,加水60℃水浴1h,雙層紗布過濾;瓊脂粉16g,去離子水定容至1L,用于馬鈴薯晚疫病菌培養(yǎng);胡蘿卜培養(yǎng)基(CA):胡蘿卜200g,組織搗碎機搗碎后4層紗布過濾;瓊脂粉16g,去離子水定容至1L,用于其余卵菌培養(yǎng)。1.2試驗植物的抗菌活性1.2.1供試植物組織制備將供試菌株在培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～5d后,用直徑為0.5cm的打孔器沿菌落邊緣打取菌餅。將供試大蒜鱗莖、洋蔥鱗莖、蔥莖組織用1.5%NaClO表面消毒3min,隨后用無菌水沖洗3次后,切成1mm3的小塊置于滅菌培養(yǎng)皿中備用。在制備好的培養(yǎng)基平板中央接種菌餅,培養(yǎng)皿蓋上放入供試植物組織,然后將已接種的皿底倒扣在皿蓋上,將培養(yǎng)皿用封口膜密封后倒置放于恒溫箱內25℃培養(yǎng)。試驗分為3個處理,每處理分別在培養(yǎng)皿蓋上放入0.5、1.0、2.0g供試植物組織,以不放植物組織的平板作為空白對照。每處理設置4次重復。培養(yǎng)3～5d后,待空白對照菌落長至培養(yǎng)皿的2/3左右,采用十字交叉法測量菌落直徑。1.2.2植物組織浸提液濃度對“生長”的影響將供試大蒜鱗莖、洋蔥鱗莖、蔥莖組織洗凈、晾干,分別稱取30g加入30mL的無菌水,在無菌研缽中搗碎,待研磨成漿后用30mL無菌水浸提2～3h,再用紗布過濾,然后將過濾液置于離心機中12000r/min離心30min,上清液用0.22μm細菌過濾膜過濾后備用。分別取制備好的植物組織浸提液9、4.5、1.8mL于3個200mL玻璃瓶中,再加入冷卻至40℃的滅菌培養(yǎng)基60mL配制成1.5mL/10mL、0.75mL/10mL、0.3mL/10mL3種不同濃度的培養(yǎng)基,混合均勻后制成平板。每一濃度設置4次重復。將供試菌餅接種于培養(yǎng)基平板中央,以培養(yǎng)基中沒有混入植物浸提液的平板為對照。置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待空白對照菌落長至培養(yǎng)皿的2/3左右,采用十字交叉法測量菌落直徑。1.2.3各處理菌落平均直徑計算利用十字交叉法測量出每種濃度下菌株的菌落生長直徑,求出各平均值帶入公式計算。抑制率=(對照菌落平均直徑?各處理菌落平均直徑對照菌落平均直徑)×100%=(對照菌落平均直徑-各處理菌落平均直徑對照菌落平均直徑)×100%。利用Excel2003軟件分析供試菌株對3種蔥屬作物不同濃度的揮發(fā)物和浸提液敏感性的相關性。2結果與分析2.1蔥、莖揮發(fā)物對供試病原菌的抑制率試驗結果表明(表2),3種蔥屬作物揮發(fā)物對供試的病原真菌和卵菌均有抑菌活性,但抑菌能力存在差異。大蒜鱗莖揮發(fā)物的抑菌效果明顯強于洋蔥鱗莖和蔥莖。除小麥赤霉病菌和辣椒早疫病菌外,大蒜鱗莖揮發(fā)物對所有供試病原菌均可在0.5g/皿的濃度下抑制率均達90%以上,且對卵菌的抑制率高于真菌;蔥莖揮發(fā)物對油菜菌核病菌、水稻稻瘟病菌和馬鈴薯晚疫病菌抑菌活性較高,揮發(fā)物濃度1.0g/皿便能完全抑制其生長,對西瓜蔓枯病菌、蘋果腐爛病菌、大豆疫霉病菌和瓜果腐霉病菌抑制率次之,在1.0g/皿的揮發(fā)物濃度下抑制率在50.2%～86.1%之間。蔥莖揮發(fā)物對其他病原菌的抑制率在10.2%～44.7%之間,其中對辣椒疫霉和小麥赤霉病菌抑制效果最差。洋蔥鱗莖揮發(fā)物對供試病原菌抑菌活性差異也較大。洋蔥鱗莖揮發(fā)物對西瓜蔓枯病菌、馬鈴薯晚疫病菌、大豆疫霉病菌和番茄莖基腐病菌的抑菌活性最高,在0.5g/皿濃度下能完全抑制生長;在1.0g/皿濃度下對棉花立枯、稻瘟病菌、蘋果輪紋、桃褐腐和蘋果腐爛病菌的抑制率在57.5%～100%之間;揮發(fā)物對其余病原菌的抑制率在3.1%～47.8%之間,對小麥赤霉菌的抑制率最低。2.2對抗菌藥物的敏感性大蒜鱗莖浸提液的抑菌活性最強(表3),在0.3mL/10mL濃度下能完全抑制供試卵菌以及除小麥赤霉菌、水稻惡苗病菌、小麥全蝕病菌、辣椒早疫病菌、棉花立枯病菌、番茄灰霉病菌和黃瓜黑星病菌外的供試真菌菌絲生長。小麥赤霉病菌對大蒜鱗莖浸提液的敏感性最低,在1.5mL/10mL濃度抑制率也僅為28.7%。蔥莖浸提液對油菜菌核病菌、棉花立枯病菌、番茄灰霉病菌、玉米小斑病菌、玉米彎孢病菌和大豆疫霉病菌的抑制效果較好,濃度為1.5mL/10mL的浸提液抑制率在53.5%～98.9%之間;對其余病原菌的抑制率在8.1%～45.9%之間,抑制率最低的為小麥赤霉病菌。洋蔥鱗莖浸提液在1.5mL/10mL濃度下能完全抑制油菜菌核病菌和棉花立枯病菌的生長;對水稻紋枯病菌、蘋果輪紋病菌和玉米彎孢病菌的抑制率次之,分別為78.4%、55.5%、64.3%;對其余供試菌株的抑制率位于3.4%～44.2%之間,最低為小麥赤霉病菌。2.3種類型洋蔥蔥莖誘導物敏感性試驗由于多數(shù)病原菌在供試大蒜揮發(fā)物和浸提液濃度下生長完全被抑制,因此無法分析菌株對大蒜、洋蔥和蔥莖敏感性的相關性。但對大蒜揮發(fā)物敏感性低的小麥赤霉病菌、辣椒早疫病菌、玉米小斑病菌株對蔥莖和洋蔥鱗莖的揮發(fā)物也表現(xiàn)低敏感性(表2);對大蒜浸提液不敏感的小麥赤霉病菌、水稻惡苗病菌、辣椒早疫病菌對蔥莖和洋蔥鱗莖的浸提液也不敏感(表3)。供試菌株對不同濃度洋蔥鱗莖和蔥莖揮發(fā)物的敏感性均表現(xiàn)出3種敏感類型(圖1,A～C)。一種類型表現(xiàn)為對供試濃度洋蔥鱗莖和蔥莖揮發(fā)物的敏感性相近,包括黃瓜枯萎病菌、水稻惡苗病菌、小麥全蝕病菌、辣椒早疫病菌、稻瘟病菌、蘋果輪紋病菌、番茄灰霉病菌、玉米彎孢病菌、桃褐腐病菌、蘋果腐爛病菌、辣椒疫病菌、馬鈴薯晚疫病菌;第二種類型為對蔥莖揮發(fā)物敏感性低而對洋蔥鱗莖揮發(fā)物敏感性高,包括西瓜蔓枯病菌、水稻紋枯病菌、棉花立枯病菌、玉米小斑病菌、大豆疫病菌、番茄莖基腐病菌、黃瓜疫病菌;第三種類型為對蔥莖揮發(fā)物敏感性高而對洋蔥鱗莖揮發(fā)物敏感性低,包括小麥赤霉病菌、油菜菌核病菌、荔枝霜疫霉、瓜果腐霉、黃瓜黑星病菌。供試菌株對不同濃度洋蔥鱗莖和蔥莖浸提液的敏感性也表現(xiàn)出3種敏感類型(圖1,D～F)。一種類型表現(xiàn)為對供試洋蔥鱗莖和蔥莖浸提液敏感性相近。包括水稻惡苗病菌、小麥全蝕病菌、稻瘟病菌、蘋果輪紋病菌、桃褐腐病菌、蘋果腐爛病菌、馬鈴薯晚疫病菌、小麥赤霉病菌、油菜菌核病菌、西瓜蔓枯病菌、黃瓜黑星病菌、荔枝霜疫霉病菌、黃瓜疫病菌、番茄莖基腐病菌;第二種類型為對蔥莖浸提液敏感性低而對洋蔥鱗莖浸提液敏感性高,包括水稻紋枯病菌、棉花立枯病菌、瓜果腐霉、玉米彎孢病菌;第三種類型為對蔥莖浸提液敏感性高而對洋蔥鱗莖浸提液敏感性低,包括黃瓜枯萎病菌、番茄灰霉病菌、辣椒疫病菌、玉米小斑病菌、大豆疫病菌和辣椒早疫病菌。3浸提液和揮發(fā)物蔥屬作物揮發(fā)物和浸提液具有廣譜的抗植物病原真菌和卵菌活性,大蒜鱗莖揮發(fā)物和浸提液的抑菌活性高于洋蔥鱗莖和蔥莖。大蒜提取液和揮發(fā)物對多種植物病原真菌具有較強的抑制作用。如大蒜提取物對半知菌類真菌早疫病菌(Alternariasolani)、絲核菌(Rhizoctoniaspp.)、灰霉病菌(Botrytiscinerea),子囊菌門真菌小核菌(Sclerotiumsp.)、白粉病菌(Erysiphepisi)、核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum),枝孢屬(Cladosporium)孢子萌發(fā)或菌絲生長均具有抑制活性,對這些病原菌引起的病害也有較好的防治效果[10,11,12,13,14,15]。大蒜揮發(fā)物和浸提液對本研究選擇的12種子囊菌和5種半知菌類典型植物病原菌也具有明顯的抑菌活性,表明大蒜揮發(fā)物和浸提液的抑菌譜廣,能用于多數(shù)植物病原真菌的防治。洋蔥鱗莖和大蔥的浸提液和揮發(fā)物對供試植物病原真菌也具有廣譜抑菌活性。前人的研究主要集中于洋蔥和蔥提取物對多種革蘭氏陽性和陰性菌以及一些霉菌的抑菌活性。本研究表明,洋蔥鱗莖和蔥浸提液和揮發(fā)物對供試的主要植物病原真菌均具有抑菌活性。卵菌也是引起植物病害的重要病原菌。蔥屬作物對卵菌門植物病原菌抑菌活性研究較少。有研究表明,大蒜根系分泌物及其活性成分大蒜素以及大蔥葉提取物對卵菌門病原菌辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)具有抑菌效果。本試驗測定的腐霉、疫霉和霜疫霉對大蒜、洋蔥和蔥的揮發(fā)物和浸提液均表現(xiàn)敏感,可以為卵菌引起的植物病害防治提供重要參考。3種蔥屬作物的廣譜抑菌特性可能與揮發(fā)物和浸提液中含有蒜素類含硫化合物有關。研究表明,蔥屬作物能產生含硫化合物,這些化合物通過對巰基的氧化,使與微生物生長繁殖有關的含硫巰基酶失活,或對含硫氧基的化合物如肌氨酸、谷氨酸產生競爭性抑制,或非競爭性的抑制某些酶的活性,從而對眾多致病菌起到抑制或殺滅作用。目前,植物病害常用化學農藥進行防治,這些農藥多屬于單作用靶標殺菌劑,病原菌容易產生抗藥性,而蔥屬作物揮發(fā)物和浸提液抑菌活性成分復雜,且對非靶標生物安全,有利于克服病原菌的抗藥性。但本試驗的結果表明,一些供試菌株對3種蔥屬作物揮發(fā)物和浸提液敏感性均較低,這可能與供試菌株對抑菌化合物的耐性有關。研究表明,雖然一些病原菌不容易對具有多靶標位點的抗菌物質產生靶標位點突變類型的抗性,但植物病原菌在與寄主的長期互作過程中已經(jīng)進化形成避讓、酶解和有毒物質外排等不同的機制來抵御植物分泌抗菌化合物的毒害。例如,豌豆基腐病菌可以產生特異性的ATP結合轉運蛋白(NhABC1)來增強其對豌豆素的抗性,同時也會產生豌豆素脫甲基酶降解豌豆素。因此,利用植物揮發(fā)或分泌的抗菌物質可以防治一些重要的土傳病害,但長期利用也可能面臨著病原菌產生耐藥性,降低防治效果的風險。另外,供試病原菌對3種蔥屬作物揮發(fā)物和浸提液敏感性相關性分析表明,一些對供試洋蔥鱗莖和蔥莖浸提液或揮發(fā)物敏感性相近;另一些則對供試洋蔥鱗莖和蔥莖浸提液或揮發(fā)物敏感性相反。這些敏感性的差異可能與大蒜、洋蔥及蔥莖浸提液或揮發(fā)物中抑菌物質的種類及含量差異有關。研究表明,大蒜、洋蔥及蔥的浸提液和揮發(fā)物中的抑菌物質主要