單克隆抗體的制備及應用

單克隆抗體的制備及應用單克隆抗體是由淋巴細胞雜交瘤產(chǎn)生的、只針對復合抗原分子上某一單個抗原決定簇。單克隆抗體技術(monoclonalantibodytechnique)：一種免疫學技術，將產(chǎn)生抗體的單個B淋巴細胞同骨髓腫瘤細胞雜交，獲得既能產(chǎn)生抗體，又能無限增殖的雜種細胞，并以此生產(chǎn)抗體。是僅由一種類型的細胞制造出來的抗體，對應于多克隆抗體、多株抗體——由多種類型的細胞制造出來的一種抗體。1單克隆抗體的優(yōu)點與局限性：1.1單克隆抗體的優(yōu)點：(1)雜交瘤可以在體外“永久”地存活并傳代，只要不發(fā)生細胞株的基因突變，就可以不斷地生產(chǎn)高特異性、高均一性的抗體。(2)可以用相對不純的抗原，獲得大量高度特異的、均一的抗體。(3)由于可能得到“無限量”的均一性抗體，所以適用于以標記抗體為特點的免疫學分析方法，如IRMA和ELISA等。(4)由于單克隆抗體的高特異性和單一生物學功能，可用于體內的放射免疫顯像和免疫導向治療?？傮w來說，即：高特異性、高純度、重復性好、敏感性強、成本低和可大量生產(chǎn)等。1.2單克隆抗體的局限性：(1)單克隆抗體固有的親和性和局限的生物活性限制了它的應用范圍。由于單克隆抗體不能進行沉淀和凝集反應，所以很多檢測方法不能用單克隆抗體完成。(2)單克隆抗體的反應強度不如多克隆抗體。(3)制備技術復雜，而且費時費工，所以單克隆抗體的價格也較高。2單克隆抗體的制備：單克隆抗體的制備原理：應用細胞雜交技術使骨髓瘤細胞與免疫的淋巴細胞二者合二為一，得到雜種的骨髓瘤細胞。這種雜種細胞繼承兩種親代細胞的特性，它既具有B淋巴細胞合成專一抗體的特性，也有骨髓瘤細胞能在體外培養(yǎng)增殖永存的特性，用這種來源于單個融合細胞培養(yǎng)增殖的細胞群，可制備抗一種抗原決定簇的特異單克隆抗體。單克隆抗體的制備過程：抗原準備、動物的選擇與免疫、細胞融合、選擇雜交瘤細胞及抗體檢測、雜交瘤的克隆化、雜交瘤細胞的凍存與復蘇、單克隆抗體的純化等步驟。2.1抗原準備抗原，是指能夠刺激機體產(chǎn)生（特異性）免疫應答，并能與免疫應答產(chǎn)物抗體和致敏淋巴細胞在體外結合，發(fā)生免疫效應（特異性反應）的物質。抗原的基本特性有兩種，一是誘導免疫應答的能力，也就是免疫原性，二是與免疫應答的產(chǎn)物發(fā)生反應，也就是抗原性。很多物質都可以成為抗原，抗原的具體分類可以參見抗原，在進行單克隆抗體制備過程中，很多物質都可以成為抗原，在常規(guī)的科研實驗中，科研者經(jīng)常選用每只小鼠/大鼠每次注射10~50ug重組蛋白、偶聯(lián)多肽、偶聯(lián)小分子等作為抗原產(chǎn)生特異性的單克隆抗體。2.2動物的選擇與免疫2.2.1動物的選擇純BALB/c小鼠，較溫順，離窩的活動范圍小，體弱，食量及排污較小，一般環(huán)境潔凈的實驗室均能飼養(yǎng)成活目開展雜交瘤技術的實驗室多選用純種BALA/c小鼠。2.2.2免疫方案選擇合適的免疫方案對于細胞融合雜交的成功，獲得高質量的McAb至關重要。一般在融合前兩月左右根據(jù)確立免疫方案開始初次免疫，免疫方案應根據(jù)抗原的特性不同而定。（1）可溶性抗原免疫原性較弱，一般要加佐劑，半抗原應先制備免疫原，再加佐劑。常用佐劑：福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑。初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐劑皮下多點注射或脾內注射（一般0.8～1ml，0.2ml/點），3周后第二次免疫，劑量同上，加福氏不完全佐劑皮下或ip（腹腔內注射）（ip劑量不宜超過0.5ml），3周后第三次免疫，劑量同一，不加佐劑，ip（5～7天后采血測其效價），2～3周加強免疫，劑量50～500μg宜，ip或iv（靜脈內注射)，3天后取脾融合。（2）顆粒抗原免疫性強，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。以細胞性抗原為例，免疫時要求抗原量為1～2×107個細胞。初次免疫1×107/0.5mlip，2～3周后，第二次免疫1×107/0.5mlip，3周后加強免疫（融合前三天）1×107/0.5mlip或iv，取脾融合。2.3細胞融合2.3.1細胞融合前準備（1）骨髓瘤細胞系的選擇：骨髓瘤細胞應和免疫動物屬于同一品系，樣雜交融合率高，也便于接種雜交瘤在同一品系小鼠腹腔內產(chǎn)生量McAb。骨髓瘤細胞的培養(yǎng)可用一般的培養(yǎng)液，如DMEM培養(yǎng)基。小牛血清的濃度一般在10%～20%，細胞濃度以104～5×105/ml為宜，最大濃度不得超過106/ml。當細胞處于對生長的中期時，可按1：3～1：10的比例傳代。每3～5天傳代一次。細胞在傳代過程中，部分細胞可能有返祖現(xiàn)象，應定期用8-氮鳥嘌呤進行處理，使生存的細胞對HAT呈均一的敏感性。（2）飼養(yǎng)細胞：在組織培養(yǎng)中，單個或少數(shù)分散的細胞不易生長繁殖，若加入其它活細胞，則可促進這些細胞生長繁殖，所加入的這種細胞數(shù)被稱為飼養(yǎng)細胞。在制備McAb的過程中，許多環(huán)節(jié)需要加飼養(yǎng)細胞，如在雜交瘤細胞篩選、克隆化和擴大培養(yǎng)過程中，加入飼養(yǎng)細胞是十分必要的。常用的飼養(yǎng)細胞有：小鼠腹腔巨噬細胞（較為常用）、小鼠脾臟細胞或胸腺細胞。飼養(yǎng)細胞的量為一般為2×104或105細胞/孔。2.3.2細胞融合的步驟①將骨髓瘤細胞與脾細胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml離心管中用無血清不完全培養(yǎng)液洗1次，離心，1200rpm，8min；棄上清，用吸管吸凈殘留液體，以免影響聚乙二醇（PEG）濃度。輕輕彈擊離心管底，使細胞沉淀略松動。②90s內加入37℃預溫的1ml45%PEG（分子量4000）溶液，邊加邊輕微搖動。37℃水浴作用90s。所識別抗原位點，來確定McAb的識別的表位是否相同。2.8.5McAb親合力的鑒定用ELISA或RIA競爭結合試驗來確定McAb與相應抗原結合的親合力。2.9單克隆抗體制備的影響因素：污染。2、PEG有毒性，可能作用時間過長，牛血清質量差，骨髓瘤細胞污染了支原體，HAT有問題，融合后雜交瘤細胞不生長。3免疫原抗原性弱，免疫效果不好，融合后有細胞生長，但無抗體產(chǎn)生（可能是HAT中的A失效，或骨髓瘤細胞發(fā)生突變，變成A抵抗細胞），原分泌抗體的雜交瘤細胞變?yōu)殛幮裕赡苁侵гw污染，或非抗體分泌細胞克隆競爭性生長），使雜交瘤細胞不分泌抗體或停止分泌抗體。4小牛血清質量問題，雜交瘤細胞活性狀態(tài)，細胞有支原體污染，使雜交瘤細胞難以克隆化等。3單克隆抗體的應用：1．檢驗醫(yī)學診斷試劑目前，應用單克隆抗體制作的商品化試劑盒廣泛應用于：①病原微生物抗原、抗體的檢測；②腫瘤抗原的檢測；③免疫細胞及其亞群的的檢測；④激素測定；⑤細胞因子的測定。單克隆抗體對抗原的識別，與多克隆抗體有很大的不同。不同試劑盒因使用的單克隆抗體不同，識別抗原的位點不同，導致檢測結果有一定差異。因此，標準化問題還需要進一步研究。2．蛋白質的提純單克隆抗體是親和層析中重要的配體。將單克隆抗體吸附在一個惰性的固相基質上，并制備成層析柱。當樣品流經(jīng)層析柱時，待分離的抗原可與固相的單克隆抗體發(fā)生特異性結合，其余成分不能與之結合。將層析柱充分洗脫后，改變洗脫液的離子強度或pH，欲分離的抗原與